Мультимодальные люминесцентные апконверсионные сенсоры температуры NaYF₄:Yb,Er,Tm для биологических приложений

Введение

В последние несколько десятилетий внимание ученых сосредоточено на люминесцентных материалах, легированных редкоземельными металлами (РЗМ), в связи с возможностью их широкого применения в цветных дисплеях, солнечных панелях, средств защиты от подделок, хемо- и биосенсорах, для биовизуализации, адресной доставки лекарств, фотодинамической терапии и диагностики онкологических заболеваний и других приложений [1—7]. Оптические характеристики РЗМ определяются внутриконфигурационными переходами между 4fn-состояниями [8, 9]. В результате кооперативных процессов возбуждения ионов РЗМ возможен нелинейных оптический процесс, называемый апконверсией, в котором поглощение двух или более низкоэнергетических фотонов ближнего инфракрасного излучения приводит к эмиссии одного фотона в ультрафиолетовой, видимой или инфракрасной области спектра [10]. Данная особенность открывает широкие перспективы применения апконверсионных микро- и наночастиц в биологии и медицине, поскольку длина волны лазерного возбуждения частиц попадает в «окно прозрачности» биологических тканей, слабо рассеивается и не приводит к деструкции живых объектов [11].

Температура — один из важнейших параметров состояния живых систем [12]. Традиционные методы измерения температуры используют макроскопические термометры, термосопротивления, термопары и полупроводниковые датчики на основе физического контакта с исследуемым объектом. Такой способ не позволяет проводить малоинвазивные измерения температуры на клеточном уровне [13]. Для этой задачи больше подходят методы люминесцентной термометрии с бесконтактным измерением температуры. В них используются температурные зависимости люминесцентных характеристик (времени жизни возбужденного состояния, положения, ширины, формы, и интенсивности пиков люминесценции и т. д.) микро- и нанозондов, внедренных в интересующую область образца [14, 15]. Наиболее простым и точным является ратиометрический метод измерения температуры по отношению интенсивностей люминесценции в разных спектральных диапазонах [16, 17]. Он позволяет устранить влияние множества систематических экспериментальных ошибок (например, флуктуации мощности лазера), что обеспечивает стабильность, точность и надежность измерений [18—21].

Для измерения температуры с помощью апконверсионных материалов чаще всего используют кристаллы, легированные ионами ^{${\text{Er}}^{\text{3+}}$} [22—25]. Диаграмма энергетических уровней показывает наличие у иона ${\text{Er}}^{\text{3+}}$ двух близкорасположенных, температурно-связанных уровней ${}^{\text{2}}{\text{H}}_{\text{11/2}}$ и ${}^{\text{4}}{\text{S}}_{\text{3/2}}$, энергетическая щель между которыми соизмерима с тепловой энергией 200—2000 см-1 [13]. Излучательная релаксация с этих уровней приводит к зеленой люминесценции (525 и 545 нм), которую и используют как источник сигнала для люминесцентной термометрии в видимом диапазоне. Следует отметить, что зеленое излучение довольно хорошо рассеивается и поглощается биологическими тканями, что является негативным фактором применения таких люминофоров в роли биозондов [26, 27]. Для создания эффективного сенсора температуры в биологических средах необходимо, чтобы и возбуждающее излучение, и люминесценция не выходили из области 650—1100 нм — первого окна оптической прозрачности биологических тканей [27]. Люминесценцией в данном спектральном диапазоне обладают ионы ${\text{Er}}^{\text{3+}}$ (655 нм) и ${\text{Tm}}^{\text{3+}}$ (700 и 805 нм) при апконверсионном характере возбуждения на длине волны 980 нм. В этом случае эмиссия есть результат излучательной релаксации с температурно-несвязанных уровней ионов ${\text{Er}}^{\text{3+}}$ и ^{${\text{Tm}}^{\text{3+}}$} [28].

Отметим еще один важнейший метод исследований, терапии и диагностики в биологии и медицине — визуализацию. Зонды, внедренные в биопрепарат, позволяют с высокой точностью регистрировать их положение с помощью методов люминесцентной спектроскопии. Данная технология лежит в основе транспорта лекарств, создания тест-систем, а также прямого и малоинвазивного метода наблюдения за биологическими процессами в живых организмах и отдельных органах [29—31]. Апконверсионные люминофоры, длины волн возбуждения и эмиссии которых попадают в «окно прозрачности» биологических тканей, идеально подходят на роль зондов в задачах биовизуализации.

В работе предлагается мультимодальное применение апконверсионных микрочастиц NaYF4: Yb3+/Er3+/Tm3+ в роли люминесцентных сенсоров температуры и зондов для визуализации биологических объектов. В микрочастицах ионы ${\text{Yb}}^{\text{3+}}$ выступают в качестве сенсибилизаторов лазерного излучения на длине волны 980 нм, а ионы ${\text{Er}}^{\text{3+}}$ и ${\text{Tm}}^{\text{3+}}$ являются излучающими центрами. Гексагональная фаза кристалла ${\text{NaYF}}_{\text{4}}$ выбрана в качестве матрицы для создания апконверсионных микрочастиц благодаря ее химической и термической стабильности, а также низкой энергии фононов решетки (≈350 см-1) [32—34]. Важно отметить, что, согласно работам [35—37], фторидные матрицы надежно обеспечивают функционал люминесцентных зондов в биологических средах и их малую инвазивность. Микрочастицы NaYF4: Yb3+/Er3+/Tm3+ в форме стержней 0.77×0.21 мкм² были синтезированы гидротермальным методом с использованием олеиновой кислоты в качестве стабилизирующего агента. В работе представлено систематическое исследование фотофизических свойств микрочастиц ${\text{NaYF}}_{\text{4}}$, легированных ионами Yb³⁺, Er³⁺ и Tm³⁺, в спектральном диапазоне 500—900 нм при температуре 250—350 К. Показана высокая температурная чувствительность апконверсионной люминесценции для полос в зеленой области спектра и в области окна оптической прозрачности биологических тканей. Указанные характеристики апконверсионных микрочастиц NaYF4: Yb3+/Er3+/Tm3+ позволяют реализовать мультимодальное измерение температуры в биологических тканях. Кроме того, благодаря интенсивной эмиссии ионов Tm3+ на 805 нм, синтезированные люминофоры могут стать отличными зондами для биовизуализации.

Эксперимент

Синтез микрочастиц NaYF4:Yb3+/Er3+/Tm3+

Частицы NaYF4:20%Yb3+/1%Er3+/1%Tm3+ были получены гидротермальным методом синтеза в соответствии со следующей процедурой [38]. 1.2 г NaOH было растворено в 2 мл деионизованной воды. Затем при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке было добавлено к раствору 8 мл этилового спирта и 20 мл олеиновой кислоты. Смесь была перемешана в течение 20 мин до получения прозрачной гомогенной системы. Далее при интенсивном перемешивании к системе было добавлено 0.78 ммоль $\text{Y}{\left({\text{NO}}_{\text{3}}\right)}_{\text{3}}$, 0.2 ммоль $\text{Yb}{\left({\text{NO}}_{\text{3}}\right)}_{\text{3}}$, 0.01 ммоль $\text{Er}{\left({\text{NO}}_{\text{3}}\right)}_{\text{3}}$ и 0.01 ммоль $\text{Tm}{\left({\text{NO}}_{\text{3}}\right)}_{\text{3}}$ (общее количество $\text{Re}{\left({\text{NO}}_{\text{3}}\right)}_{\text{3}}$ — 1.0 ммоль, Re — РЗМ). Отдельно был приготовлен 1.0 М водный раствор NaF объемом 8 мл, который был прилит к системе, содержащей редкоземельные ионы. Наконец, после перемешивания в течение 30 мин смесь была помещена в 50 мл автоклав из нержавеющей стали с тефлоновым покрытием и была выдержана в течение 24 ч при 190°C. Осадок был промыт несколько раз этанолом и деионизированной водой и высушен на воздухе при 60°C в течение 12 ч. Порошок микрочастиц был растворен в циклогексане и подвергнут ультразвуковой обработке для получения хорошо диспергированной суспензии.

Методы характеризации

Размер и морфология поверхности микрочастиц были исследованы с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) EVO 50 XVP (Carl Zeiss). После того как несколько капель суспензии микрочастиц было нанесено на подложку из высоколегированного проводящего кремния, а растворитель был испарен, порошок микрочастиц был исследован в камере микроскопа.

Спектры апконверсионной люминесценции были получены с использованием модульного спектрофлуориметра HORIBA FL-QM-8075-22-C с непрерывным возбуждением диодным лазером на длине волны 980 нм и регистрацией на ФЭУ R13456 (Hamamatsu) с мультищелочным катодом. Исследование температурной чувствительности люминесцентных характеристик выполнено в оптическом криостате ST-100 (Janise) с шагом 10 К в диапазоне температур 250—350 К при постоянной мощности возбуждающего излучения 675 мВт. Для изучения влияния мощности возбуждающего инфракрасного излучения на интенсивность и форму спектра апконверсионной люминесценции образец помещали в стандартный держатель образцов без температурной стабилизации. Образец был приготовлен следующим образом. Суспензию микрочастиц по одной капле наносили на две пластины покровного стекла. После испарения циклогексана пластины были склеены и помещены в камеру криостата спектрофлуориметра.

Результаты и их обсуждение

На рис. 1 показаны изображения СЭМ микрочастиц NaYF4:Yb3+/Er3+/Tm3+. Микрочастицы имеют форму стержней, средняя длина и ширина которых составляет 0.77 и 0.21 мкм, соответственно.

Рис. 1. СЭМ изображение микрочастиц NaYF₄: Yb³⁺/Er³⁺/Tm³⁺ (а). Распределение микрочастиц по размерам: длина (б) и ширина (в).

На рис. 2а представлен спектр излучения микрочастиц NaYF4:Yb3+/Er3+/Tm3+ под действием 980 нм лазерного возбуждения. Спектр эмиссии имеет характерные полосы с максимумами на 525, 545, 655, 700 и 805 нм, которые соответствуют излучательным переходам ²H_11/2 → ⁴I_15/2(Er³⁺ : 525 нм), ⁴S_3/2 → ⁴I_15/2(Er³⁺ : 545 нм), ⁴F_9/2 → ⁴I_15/2(Er³⁺ : 655 нм), ³F₂ → ³H₆(Tm³⁺ : 700 нм) и ³H₄ → ³H₆(Tm³⁺ : 805 нм), соответственно. Отметим, что пиковая интенсивность полосы 805 нм на порядок превышает интенсивность остальных полос.

Рис. 2. Спектр апконверсионной люминесценции микрочастиц NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Tm³⁺ при возбуждении лазером с длиной волны 980 нм (а). Зависимость интенсивности люминесценции от мощности возбуждающего излучения (б). Схематическая диаграмма энергетических уровней и процессы переноса в апконверсионных наночастицах NaYF₄, легированных ионами Yb³⁺, Er³⁺ и Tm³⁺ (в).

Схематическая диаграмма энергетических уровней и процессы переноса в апконверсионных микрочастицах NaYF4:Yb3+/Er3+/Tm3+ показаны на рис. 2в. Для начала рассмотрим процессы переноса, происходящие в системе ${\text{Yb}}^{\text{3+}}{\text{-Er}}^{\text{3+}}$. Под действием лазерной накачки 980 нм происходит поглощения кванта ближнего инфракрасного излучения и переход иона ${\text{Yb}}^{\text{3+}}$ из основного состояния ²F_7/2 в состояние ²F_5/2. Энергетический уровень ${}^{\text{4}}{\text{F}}_{\text{7/2}}{\text{ (Er}}^{\text{3+}}\text{)}$ оказывается заселен в результате процесса безызлучательной передачи энергии ${\text{Yb}}^{\text{3+}}\to {\text{Er}}^{\text{3+}}$:

⁴I_15/2(Er³⁺) + ²F_5/2(Yb³⁺)→

→⁴I_11/2(Er³⁺) + ²F_7/2(Yb³⁺). (1)

Перенос второго кванта энергии от иона Yb³⁺ приводит к заселению энергетического уровня ⁴F_7/2(Er³⁺):

⁴I_11/2(Er³⁺) + ²F_5/2(Yb³⁺)→

→ ⁴F_7/2(Er³⁺) + ²F_7/2(Yb³⁺). (2)

В результате безызлучательной релаксации с возбужденного состояния ${}^{\text{4}}{\text{F}}_{\text{7/2}}$ оказываются заселенными уровни ${}^{\text{2}}{\text{H}}_{\text{11/2}}{\text{,}}^{\text{4}}{\text{S}}_{\text{3/2}}и{}^{\text{4}}{\text{F}}_{\text{9/2}}иона{\text{Er}}^{\text{3+}}$. Их излучательная релаксация приводит к люминесценции в зеленой (²H_11/2, ⁴S_3/2 → ⁴I_15/2) и красной (⁴F_9/2 → ⁴I_15/2) спектральных областях. Отметим, что уровень ${}^{\text{4}}{\text{F}}_{\text{9/2}}\left({\text{Er}}^{\text{3+}}\right)$ может быть заселен и иным путем:

⁴I_13/2(Er³⁺) + ²F_5/2(Yb³⁺)→

→ ⁴F_9/2(Er³⁺) + ²F_7/2(Yb³⁺), (3)

где ион ${\text{Er}}^{\text{3+}}$ поглощает второй квант энергии, находясь в состоянии ${}^{\text{4}}{\text{I}}_{\text{13/2}}$, в которое он перешел из состояния ⁴I_11/2 по многофононному механизму.

Далее рассмотрим процессы апконверсии в системе Yb³⁺-Tm³⁺. Состояние 3H6 (Tm3+) оказывается заселенным в результате безызлучательного переноса энергии от иона ${\text{Yb}}^{\text{3+}}\to {\text{Tm}}^{\text{3+}}$:

³H₆(Tm³⁺) + ²F_5/2(Yb³⁺)→

→ ³H₅(Tm³⁺) + ²F_7/2(Yb³⁺). (4)

Энергетические уровни ${}^{\text{3}}{\text{F}}_{\text{2}}{\text{ (Tm}}^{\text{3+}}\text{) }и{}^{\text{1}}{\text{G}}_{\text{4}}{\text{ (Tm}}^{\text{3+}}\text{)}$ заселяются с последующим переносом энергии от иттербия ${\text{Yb}}^{\text{3+}}$:

(³F₄(Tm³⁺) + ²F_5/2(Yb³⁺)→

→ ³F₂(Tm³⁺) + ²F_7/2(Yb³⁺), (5)

⁴H₄(Tm³⁺) + ²F_5/2(Yb³⁺)→

→ ¹G₄(Tm³⁺) + ²F_7/2(Yb³⁺)), (6)

Синяя полоса (которая не попала в спектральный диапазон на рис. 2а), красная и инфракрасная полосы на 480, 700 и 805 нм является результатом излучательных переходов: ¹G₄ → ³H₆, ¹G₄ → ³F₄, ³F₂ → ³H₆ и ³H₄ → ³H₆, соответственно.

Для подтверждения механизма апконверсии была измерена зависимость интенсивности люминесценции микрочастиц от мощности возбуждающего изучения. Вдали от насыщения интенсивность люминесценции I нелинейно зависит от мощности накачки P:

I µ Pⁿ, (7)

где n — среднее число поглощенных фотонов накачки в совокупном апконверсионном процессе. По наклону аппроксимирующей прямой в двойном логарифмическом масштабе ln(I)—ln(P) на рис. 2б определены значения n, которые составили 1.83, 1.81, 1.91, 1.81 и 1.91 для линий 525, 545, 655, 700 и 805 нм, соответственно. Согласно [39, 40], степень нелинейности двухфотонного апконверсионного процесса лежит в диапазоне 1 < n ≤ 2, что хорошо согласуется с представленными данными.

Для исследования температурной чувствительности люминесцентных свойств были измерены спектры эмиссии микрочастиц NaYF4: Yb3+/Er3+/Tm3+ в диапазоне температур 250—350 К. Данные на рис. 3 нормированы на интенсивность полосы 525 нм. Видно, что рост температуры приводит к уменьшению нормированных интенсивностей линий 545, 655, 700 и 805 нм. Эту особенность мы связываем с обеднением населенностей соответствующих уровней ${}^{\text{4}}{\text{S}}_{\text{3/2}}{\text{(Er}}^{\text{3+}}\text{)}\text{,}{}^{\text{4}}{\text{F}}_{\text{9/2}}{\text{(Er}}^{\text{3+}}\text{)}\text{,}{}^{\text{3}}{\text{F}}_{\text{2}}{\text{(Tm}}^{\text{3+}}\text{) }и{}^{\text{3}}{\text{H}}_{\text{4}}{\text{(Tm}}^{\text{3+}}\text{)}$ из-за увеличения безызлучательной релаксации.

Рис. 3. Спектры апконверсионной люминесценции микрочастиц NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Tm³⁺ при разной температуре.

На основе анализа измеренной температурной зависимости люминесцентных свойств микрочастиц NaYF4: Yb3+/Er3+/Tm3+ можно сделать вывод о возможности их использовать в роли сенсоров температуры на основе ратиометрического метода для выбранных спектральных амплитуд люминесценции. Например, можно использовать температурно-связанные уровни ионов ${\text{Er}}^{\text{3+}}{\text{(}}^{\text{2}}{\text{H}}_{\text{11/2}}и{}^{\text{4}}{\text{S}}_{\text{3/2}}\text{)}\text{,}$ для которых отношение интегральных интенсивностей _{$I_{525}$} и $I_{545}$ полос с максимумами на 525 нм (переход ²H_11/2 → ⁴I_15/2) и 545 нм (⁴S_3/2 → ⁴I_15/2) будет зависеть от температуры следующим образом:

R_525/545(T) = I₅₂₅/I₅₄₅ = C·exp(-ΔE/kT), (8)

где ΔE — константа, по величине близкая к энергетическому зазору между уровнями ${}^{\text{2}}{\text{H}}_{\text{11/2}}и{}^{\text{4}}{\text{S}}_{\text{3/2}}\text{,}$ $k$ — постоянная Больцмана, $T$ — абсолютная температура и $C$ — коэффициент пропорциональности.

Для оценки эффективности сенсора используется параметр чувствительности $S\left(T\right)$, который показывает скорость изменения величины R с изменением температуры $T$:

$S\left(T\right)=\frac{d}{dT}R\left(T\right).$ (9)

На рис. 4 показана зависимость отношения интегральных интенсивностей $R_{525/545}$ от температуры. Выражение (8) хорошо описывает температурную зависимость микрочастиц со значениями констант:

$R_{525/545}\left(T\right)=3.6 e^{-753/T}$. (10)

Для такой зависимости максимальная чувствительность $S_{525/545}$ составляет $\text{25}{\text{.8·10}}^{\text{-4}}{К}^{\text{-1}}$ при 350 К.

Рис. 4. Температурная зависимость R_525/545(T) (зеленые квадраты — экспериментальные данные, зеленая сплошная линия — калибровочная кривая), зависимость абсолютной чувствительности S_525/545 от температуры T (синяя сплошная линия).

В биологических объектах предпочтительнее выбрать длинноволновое излучения в качестве рабочего диапазона. В область первого биологического «окна прозрачности» попадают эмиссионные полосы 655, 700 и 805 нм, соответствующие излучательным переходам с уровней ⁴F_9/2(Er³⁺), ³F₂ и ³H₄(Tm³⁺). В этом случает в роли калибровочной функции удобно использовать полиномиальную функцию третьей степени [41]:

$R\left(T\right)={\sum }_{i=0}^3{B}_{\text{i}}{T}^{\text{i}},$ (11)

где B_i — коэффициенты разложения. Температурная чувствительность для (11) будет иметь вид:

$S\left(T\right)={\sum }_{i=1}^{3}i{B}_{\text{i}}{T}^{\text{i}-1}.$ (12)

На рис. 5 показаны зависимости R_805/655(T) и R_805/700(T), вычисленные для полос с максимумами на 805 и 655 нм, 805 и 700 нм, соответственно. Параметры аппроксимирующих кривых представлены в табл. 1. Максимальные значения чувствительностей S_805/655 и S_805/700 составляют ${\text{630·10}}^{\text{-4}}$ и ${\text{3163·10}}^{\text{-4}}{К}^{\text{-1}}$ при температурах 350 и 290 К, соответственно.

Рис. 5. Температурные зависимости R_805/655(T) (а) и R_805/700(T) (б) для излучательтных переходов с уровней ³H₄(Tm^3+) и 4F_9/2⁽Er^3+),3H₄(Tm^3+) и 3F₂⁽Tm³⁺⁾ (бордовые квадраты — экспериментальные данные, бордовая сплошная линия — аппроксимация), зависимость абсолютных чувствительностей S_805/655 и S_805/700 от температуры T (синие сплошные линии).

Таблица 1. Значения коэффициентов разложения B_i в (11) для симуляции температурных зависимостей R(T) и максимальная температурная чувствительность S(T).

Следует отметить, что для калибровки температурных зависимостей можно использовать и другие сочетания интенсивностей полос из зеленой, красной и инфракрасной областей спектра люминесценции. Соответствующие результаты, полученные на основе выражений (11) и (12), показаны на рис. 6. Используемые при этом коэффициенты приведены в табл. 1. Заметим, что максимальная чувствительность $S_{545/805}$ = ${\text{3163·10}}^{\text{-4}}{К}^{\text{-1}}$ достигается с использованием интенсивностей полос 545 и 805 нм при температуре 350 К.

Рис. 6. Температурные зависимости R_525/655(T) (а), R_525/700(T) (б), R_525/805(T) (в) и R_545/805(T) (г) (красные квадраты — экспериментальные данные, красная сплошная линия — калибровочная кривая), зависимость абсолютных чувствительностей S_525/655, S_525/700, S_525/805 и S_545/805 от температуры Т (синие сплошные линии).

Для сравнения полученных результатов с имеющимися литературными данными в табл. 2 приведены максимальные значения абсолютных чувствительностей для измерения температуры на основе оптических переходов в первом окне прозрачности биологических тканей для ряда аналогичных апконверсионных частиц. Как можно заметить, по этому показателю представленные нами сенсоры значительно превосходят большинство аналогов, описанных в литературе, и сопоставимы с наиболее чувствительными сенсорами [49]. Данное обстоятельство подчеркивает значимость предложенных нами сенсоров и перспективность их применения в биологических приложениях.

Таблица 2. Сравнение максимальных значений абсолютных чувствительностей S(T) апконверсионных сенсоров для ратиометрического метода измерения температуры R(T) на основе оптических переходов в окне биологической прозрачности.

Заключение

Синтезированные нами микрочастицы NaYF4: Yb3+/Er3+/Tm3+ размерами 0.21×0.77 мкм² обладают апконверсионными свойствами. Установлено, что за счет эффективного переноса энергии от ионов ${\text{Yb}}^{\text{3+}}$ к ионам Er3+ и Tm3+ происходит конверсия двух фотонов излучения с длиной волны 980 нм в один фотон зеленой, красной или ближней инфракрасной областей оптического спектра. Широкий набор узких эмиссионных полос ионов Er3+ и Tm3+ позволяет реализовать удаленное измерение температуры на основе ратиометрического принципа. Проведенная температурная калибровка показала возможность мультимодального измерения температуры в диапазоне 250—350 К. Наибольший интерес для биологических задач представляет калибровка на основе полос 805 и 700 нм, попадающих в «окно прозрачности» биологических тканей. Важно отметить, что в этом случае абсолютная температурная чувствительность ${\text{3163·10}}^{\text{-4}}{К}^{\text{-1}}$ сопоставима с лучшими аналогами среди апконверсионных сенсоров.

Синтез частиц NaYF4: Yb3+/Er3+/Tm3+ выполнен в рамках работ по гранту Российского научного фонда № 23-42-10012, https://rscf.ru/project/23-42-10012/. Эксперименты по люминесцентной спектроскопии выполнены при поддержке Минобрнауки России в рамках Федерального проекта «Подготовка кадров и научного фундамента для электронной промышленности» государственной программы Российской Федерации «Научно-технологическое развитие Российской Федерации» при реализации Программы развития «Технологии атомно-слоевого осаждения и разработки прекурсоров для микроэлектроники и фотоники» (соглашения 075-02-2024-1503 от 29.02.2024 и 075-02-2024-1499 от 29.02.2024) в ФИЦ КазНЦ РАН.