Associations Oxidative Stress Peripheral Markers with Clinical Characteristics and Inflammatory Factors in Alcoholic Patients

全文:

Принятые сокращения: ААС – алкогольный абстинентный синдром; АЗ – алкогольная зависимость; ИЛ – интерлейкин; ИФНγ – интерферон гамма; КБ – карбонилы белков; ОС – окислительный стресс; ПОЛ – перекисное окисление липидов; ТБК – тиобарбитуровая кислота; ТБК-РП – ТБК-реактивные продукты; ФНОα – фактор некроза опухоли альфа; 8-OH-dG – 8-гидрокси-2′-дезоксигуанозин(8-оксо-7,8-дигидро-2′-дезоксигуанозин).

ВВЕДЕНИЕ

Современные исследования в области биологической наркологии показывают, что течение алкоголизма (алкогольной зависимости, АЗ), как и многих патологических состояний, сопровождается окислительным стрессом (ОС). При алкоголизме, помимо общих механизмов формирования и развития ОС, имеются специфические, которые связаны с дополнительными источниками генерации свободных радикалов, в том числе и активных форм кислорода (АФК), в результате трансформации этанола и его основного метаболита ацетальдегида в организме [1–3].

Алкоголь преодолевает гематоэнцефалический барьер, вызывая активацию микроглии, приводя к усилению продукции провоспалительных цитокинов, нейровоспалению в центральной нервной системе, нарушению нейроиммунной коммуникации, что отражается на поведенческих реакциях пациентов [4–6]. Кроме того, длительное употребление алкоголя ослабляет кишечный барьер, способствуя выходу в кровь бактериальных компонентов, таких как липополисахариды (ЛПС), которые активируют иммунную систему главным образом через рецепторы иммунных клеток (TLR4), с повышением уровня циркулирующих цитокинов, развитием воспалительного процесса и опосредованным алкоголем поражением внутренних органов [7].

Активированные клетки иммунной системы генерируют АФК, воспалительный процесс всегда сопровождается окислительным стрессом [8, 9]. Нарушения антиоксидантной и иммунной защит при длительном потреблении алкоголя способствуют формированию у пациентов сопутствующей соматической патологии, в существенной мере снижающей эффективность стандартной терапии. На основе данных о молекулярных механизмах повреждающего действия этанола на клетки системы и органы разрабатываются и внедряются в практику новые вспомогательные терапевтические подходы, которые заключаются в дополнительном назначении к стандартной терапии различных препаратов, направленных на молекулярные мишени токсического воздействия этанола, что позволяет существенно повысить эффективность лечения [10]. Важная информация о фундаментальных процессах, вовлеченных в патогенез АЗ, необходимая для совершенствования существующих и разработки новых методов лечения, может быть получена при изучении особенностей ОС на разных этапах течения заболевания и выявлении клинико-биологических ассоциаций.

Целью настоящей работы было изучение периферических маркеров окислительного стресса у больных алкогольной зависимостью в ранний период постабстинентного состояния и выявление их взаимосвязи с клиническими характеристиками заболевания и факторами воспаления.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Анализировали показатели 84 больных алкоголизмом мужчин в возрасте 30–60 лет (средний возраст – 44,3 ± 8,2 года), поступивших на лечение в клинику НИИ психического здоровья с диагнозом по МКБ-10 «Психические и поведенческие расстройства в результате употребления алкоголя (синдром зависимости – F10.21 и синдром отмены – F10.30)», с давностью заболевания 13,6 ± 8,0 лет. Диагностическую оценку и клиническую верификацию диагноза проводили врачи-наркологи отделения аддиктивных состояний (научный руководитель отделения – академик РАН Н.А. Бохан). На каждого пациента заполняли «Карту стандартизованного описания обследуемого», в которую, кроме общих идентифицирующих данных, вносили клинические характеристики заболевания, среди них – возраст на момент обследования; возраст формирования алкогольного абстинентного синдрома (ААС); давность заболевания, которую исчисляли от возраста формирования ААС до возраста пациента на дату обследования; продолжительность ААС после отмены приема алкоголя. Контролем при биологических исследованиях служили образцы крови 80 условно здоровых мужчин (средний возраст – 40,9 ± 9,6 года), не имеющих проблем с употреблением алкоголя, а также хронических соматических заболеваний в стадии обострения и признаков перенесенных острых инфекционных заболеваний. Из 37 образцов крови здоровых мужчин была получена плазма, которую затем использовали для определения маркеров ОС. Кровь других 43 условно здоровых мужчин использовали для получения сыворотки крови, в которой определяли медиаторы воспаления.

Кровь у пациентов брали на 3–5 день их поступления в стационар после алкогольной детоксикации, направленной на удаление из токсических веществ и редукцию ААС. Периферическую венозную кровь у больных АЗ и лиц группы контроля отбирали утром натощак с использованием стерильной системы однократного применения Vacutainer («Becton Dickinson», США) в пробирки, покрытые гепарином (для получения плазмы крови) и активатором свертывания крови (для получения сыворотки крови). Кровь центрифугировали, сыворотку и плазму разливали по аликвотам и хранили при температуре –80 °С до использования.

В плазме крови определяли продукты окисления белков по концентрации карбонилов белков (КБ) с использованием метода, основанного на реакции взаимодействия карбонильных производных белков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов [11]. Использовали 2,4-динитрофенилгидразин («Panreac», Испания). Концентрацию КБ выражали в нмоль/мг белка. Общий белок определяли с помощью набора Total Protein 120 («Cormay», Польша), выражали в мг/мл. Продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по концентрации реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) реактивных продуктов (ТБК-РП) с использованием набора TBA AGAT («Агат-Мед», Россия), концентрацию ТБК-РП выражали в нмоль/мл. Измерение концентрации продукта окислительного повреждения ДНК – 8-гидрокси-2′-дезоксигуанозина (8-OH-dG) – проводили иммуноферментным методом с использованием набора DNA Damage Competitive Elisa Kit («Thermo Fisher Scientific», США), концентрацию 8-OH-dG выражали в нг/мл. Измерение оптической плотности проб и расчет концентраций окисленных продуктов макромолекул плазмы крови осуществляли на приборе EPOCH («Bio Tek Instruments», США).

Факторы воспаления оценивали по уровню провоспалительных цитокинов в сыворотке крови. Определяли концентрацию интерферона гамма (ИФНγ); интерлейкина 1 бета (ИЛ-1β); интерлейкина 6 (ИЛ-6); интерлейкина 8 (ИЛ-8); интерлейкина 17А (ИЛ-17А) и фактора некроза опухоли альфа (ФНОα) – на мультиплексном анализаторе MAGPIX («Luminex», США) (ЦКП «Медицинская геномика», Томский НИМЦ) с использованием наборов реагентов MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel («Merck», Германия), выражали в пг/мл.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы SPSS, версия 23.0 для Windows. Описательная статистика представлена медианой и межквартильным интервалом Ме [Q_L–Q_U]. Возраст участников исследования и длительность заболевания представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения (М ± σ). Проверку на нормальность распределения значений переменных проводили по критерию Шапиро–Уилка. Для межгруппового сравнения использовали критерий Манна–Уитни. Корреляционный анализ проводили с помощью рангового коэффициента корреляции Спирмена. Корреляционные взаимосвязи и различия между группами считали значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В табл. 1 приведены данные клинического обследования пациентов.

 

Таблица 1. Клинические характеристики больных алкоголизмом (n = 84); Me [Q_L–Q_U]

Возраст, лет	44,50 [38, 00–50, 00]
Возраст формирования ААС, лет	30,00 [25, 00–35, 00]
Давность заболевания, лет	12,50 [7, 00–19, 00]
Продолжительность ААС, сутки	4,00 [2, 00–4, 00]

Примечание. n – Количество обследованных лиц; ААС – алкогольный абстинентный синдром.

 

Биологические исследования у больных алкоголизмом проведены в ранний период постабстинентного состояния после алкогольной детоксикации.

В табл. 2 представлены результаты сравнительного изучения периферических маркеров ОС у больных АЗ и здоровых лиц.

 

Таблица 2. Периферические маркеры окислительного стресса в плазме крови больных алкоголизмом и здоровых лиц; Me [Q_L–Q_U]

Показатель	Больные алкоголизмом, n = 84	Контроль, n = 37	p между группами
КБ, нмоль/мг белка	0,42 [0, 35–0, 49]	0,33 [0, 27–0, 39]	<0,001
ТБК-РП, нмоль/мл	2,97 [2, 50–3, 55]	2,40 [2, 10–2, 80]	<0,001
8-OH-dG, нг/мл	13,30 [9, 84–16, 08]	12,84 [11, 16–16, 45]	0,908

Примечание. n – Количество обследованных лиц; КБ – карбонилы белков; ТБК-РП – ТБК-реактивные продукты; 8-OH-dG – продукт окислительной модификации ДНК.

 

В табл. 3 приведены результаты исследования периферических цитокинов – медиаторов воспаления – у больных алкоголизмом.

 

Таблица 3. Концентрация провоспалительных цитокинов у больных алкоголизмом и здоровых лиц; Me [Q_L–Q_U]

Показатель	Больные алкоголизмом, n = 31	Контроль, n = 43	p между группами
ИФНγ, пг/мл	32,46 [29, 36–35, 44]	3,07 [0, 88–5, 47]	p < 0,001
ИЛ-1β, пг/мл	5,56 [4, 91–6, 41]	0,68 [0, 25–2, 46]	р < 0,001
ИЛ-6, пг/мл	5,96 [4, 74–10, 47]	1,26 [0, 35–4, 06]	р < 0,001
ИЛ-8, пг/мл	26,38 [19, 72–40, 53]	8,59 [5, 69–13, 78]	р < 0,001
ИЛ-17А, пг/мл	24,27 [22, 53–27, 82]	2,83 [1, 07–5, 17]	р < 0,001
ФНОα, пг/мл	30,03 [28, 55–38, 67]	9,75 [7, 00–12, 49]	р < 0,001

Примечание. n – Количество обследованных лиц; ИФНγ – интерферон гамма; ИЛ-1β – интерлейкин 1 бета; ИЛ-6 – интерлейкин 6; ИЛ-8 – интерлейкин 8; ИЛ-17А – интерлейкин 17А; ФНОα – фактор некроза опухоли альфа.

 

Основной целью нашего исследования являлось выявление взаимосвязей маркеров ОС с клиническими характеристиками заболевания и факторами воспаления. Проведенный корреляционный анализ выявил статистически значимые взаимосвязи, представленные в табл. 4.

 

Таблица 4. Корреляционные связи периферических маркеров окислительного стресса с клиническими характеристиками и факторами воспаления у больных алкоголизмом

Параметры	Коэффициент Спирмена (rs)	p
ТБК-РП и давность заболевания	0,201	0,049
КБ и возраст формирования ААС	−0,245	0,025
КБ и продолжительность ААС	−0,246	0,024
КБ и ИЛ-6	−0,620	0,003
8-OH-dG и ИЛ-6	0,433	0,044
ТБК-РП и ИЛ-8	0,457	0,049
ТБК-РП и ФНОα	0,468	0,037

Примечание. КБ – Карбонилы белков; ТБК-РП – ТБК-реактивные продукты; 8-OH-dG – продукт окислительной модификации ДНК; ААС – алкогольный абстинентный синдром; ИЛ-6 – интерлейкин 6; ИЛ-8 – интерлейкин 8; ФНОα – фактор некроза опухоли альфа.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Измерение периферических маркеров окислительного стресса – продуктов окисления липидов, белков и ДНК плазмы крови – у больных алкоголизмом в ранний период постабстинентного состояния показало наличие у пациентов выраженного окислительного стресса. Это следует из статистически значимо повышенных концентраций карбонилов белков и ТБК-реактивных продуктов плазмы крови у пациентов по сравнению с контролем (табл. 2). О значительном увеличении периферических маркеров ОС – продукта ПОЛ малонового диальдегида и карбонилов белков в сыворотке крови больных алкоголизмом, по сравнению со здоровыми лицами, сообщается в работах других авторов [12, 13].

В то же время концентрация продукта окислительной модификации ДНК у больных АЗ не отличалась от контроля (табл. 2). Ранее мы сообщали о повышении концентрации 8-OH-dG в образцах плазмы крови, полученных у больных АЗ при поступлении в стационар в состоянии ААС [14]. В литературе есть данные о повышении уровня 8-OH-dG у больных алкоголизмом как в состоянии ААС, так и после 1-недельной детоксикации [15]. Разные результаты можно объяснить этапами заболевания, на которых проводились исследования, а также большим разнообразием механизмов, которые в организме человека могут влиять на уровень продуктов окисления ДНК в плазме крови. Анализ литературных данных о биомедицинских свойствах, механизмах действия и возможных терапевтических эффектах таких метаболитов ДНК проведен в обзоре Черникова и др. [16]. Известно более 30 продуктов окислительной модификации азотистых оснований нуклеиновых кислот, среди которых наиболее изучены 8-оксо-7,8-дигидрогуанин (8-oxo-G) и 8-гидрокси-2′-дезоксигуанозин (8-OH-dG). Образование 8-oxo-G является наиболее распространенным видом окислительного повреждения нуклеиновых кислот [17], а 8-OH-dG считаются одними из основных биомаркеров окислительного стресса [15, 18]. Показано, что свободный 8-oxo-G играет роль медиатора стрессовой сигнализации в клетке, запуская и потенцируя воспалительные и иммунные реакции с целью поддержания гомеостаза при действии внешних агентов, в то время как 8-OH-dG может проявлять выраженные противовоспалительные и антиоксидантные свойства [16]. В другой работе – обзоре литературных источников, касающихся биологической роли 8-оксо-2′-dG [19], – при рассмотрении антиоксидантных и противовоспалительных свойств этого соединения отмечается, что в ряде работ показано повышение содержания этого продукта окисления ДНК в первое время действия стрессового фактора, а затем – возвращение к нормальным или даже пониженным значениям. Отмечается, что в период компенсации происходит резкий рост активности антиоксидантных и репаративных ферментов. Вопрос, сам ли продукт окисления ДНК вызывает усиление экспрессии генов этих ферментов или это происходит в результате действия других факторов, остается нерешенным. Однако, кроме того, что 8-OH-dG довольно давно и успешно используется в качестве биомаркера ОС, есть данные, свидетельствующие об участии этого соединения в регуляции экспрессии генов, в процессах репарации ДНК, контроле воспалительных и аутоиммунных реакций, запуске антиоксидантных систем [19]. Таким образом, факт отсутствия различий в уровне продукта окисления ДНК 8-OH-dG в плазме крови больных АЗ, по сравнению с контролем, в нашем исследовании вполне объясним, поскольку этот метаболит не только накапливается в организме во время ОС, но и активно включается в регуляцию метаболических процессов, которые, в свою очередь, могут влиять на его концентрацию в плазме крови.

Определение провоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных алкоголизмом показало, что концентрация всех исследованных медиаторов воспаления существенно выше контроля (р < 0,001 во всех случаях). Наибольшее повышение концентрации (более чем на порядок) обнаружено у ИФНγ (табл. 3). Ранее, при изучении спонтанной продукции цитокинов (ИФНγ, ИЛ-17A, ИЛ-1Ра, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОα) иммунокомпетентными клетками, было выявлено значительное повышение спонтанной продукции цитокинов в супернатантах культур образцов крови больных АЗ по сравнению со здоровыми лицами [20]. Установлены корреляционные взаимосвязи между спонтанной продукцией цитокинов клетками крови больных АЗ и продуктами окисления белков и липидов плазмы крови этих больных [21]. Обнаруженные корреляции косвенно свидетельствуют о стимулирующем влиянии этанола и продуктов его метаболизма на иммунокомпетентные клетки in vivo. При этом продукты окисления этанола могут по-разному модулировать синтез цитокинов, что было продемонстрировано на модели потребления алкоголя (на крысах) при оценке роли алкоголь-индуцированного окислительного стресса в модуляции выработки цитокинов в гепатоцитах и клетках Купфера печени [22]. Выявлено, что продукты окисления по-разному модулируют синтез провоспалительных цитокинов/хемокинов через транскрипционный фактор NF-κB, ацетилирование гистонов, нарушение стабильности мРНК. Так, пероксид водорода (H₂O₂) стимулировал ЛПС-индуцированное производство цитокинов/хемокинов в клетках Купфера, в то время как 4-гидроксиноненаль оказывал ингибирующее действие.

Изучение корреляционных связей маркеров окислительного стресса и клинических характеристик заболевания выявило отрицательные ассоциации концентрации КБ с возрастом формирования ААС, а также с продолжительностью ААС после отмены алкоголя (табл. 4). В механизмах формирования и развития алкогольной зависимости задействованы многие молекулярные пути, и однозначно объяснить выявленные взаимосвязи не представляется возможным. Тем не менее можно определенно говорить о том, что карбонилы белков вовлечены в эти механизмы.

Выявлена также прямая связь уровня продуктов перекисного окисления липидов (ТБК-РП) с давностью заболевания. Известно, что старение связано с увеличением количества продуктов окисления биомакромолекул [23–25]. В работе Spiteller [25] приводятся доказательства того, что продукты ПОЛ образуются в результате процессов, индуцированных изменениями структуры клеточной мембраны, которые происходят при старении, а также при действии неблагоприятных факторов, к которым можно отнести и систематическое длительное потребление алкоголя. Структурные изменения биомембран при действии этанола приводят к активации мембраносвязанных фосфолипаз, что индуцирует приток ионов Са2+ и активацию липоксигеназ, превращающих полиненасыщенные жирные кислоты в гидроперекиси липидов, которые могут разлагаться под действием ферментов до сигнальных соединений. Индуцируются процессы неферментативного ПОЛ, продолжается накопление продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой – ТБК-РП [24]. Выявленная в нашей работе корреляция ТБК-РП с давностью заболевания может быть связана с этим механизмом накопления продуктов ПОЛ у больных алкогольной зависимостью.

Обнаруженные в настоящем исследовании корреляционные связи параметров окислительного стресса и провоспалительных цитокинов подтверждают тесную взаимосвязь воспаления и ОС [8, 9]. Особенно значимой является связь маркеров ОС с ИЛ-6 – важнейшим медиатором воспаления, индуцирующим синтез белков острой фазы. Отметим наиболее сильную из всех выявленных ассоциаций обратную связь КБ с ИЛ-6 и прямую связь умеренной силы 8-OH-dG с этим цитокином (табл. 4). Как уже упоминалось, есть данные, что 8-OH-dG проявляет выраженные антиоксидантные свойства [16, 19]. Одним из объяснений полученных ассоциаций может быть следующее: в результате воспалительного процесса при нарастании ИЛ-6 происходит окисление макромолекул плазмы крови c повышением, в том числе продуктов окисления ДНК (8-OH-dG), отсюда прямая связь ИЛ-6 с 8-OH-dG. Поскольку 8-OH-dG может оказывать антиоксидантный эффект, его накопление в крови может препятствовать окислению белков, снижать концентрацию карбонилов белков крови. Это, в свою очередь, может приводить к выявленной в нашей работе отрицательной корреляции между ИЛ-6 и концентрацией КБ.

Приведенные объяснения ассоциаций маркеров ОС с клиническими характеристиками заболевания и медиаторами воспаления являются лишь гипотетическими. Необходимы дальнейшие исследования и накопление данных для выявления взаимовлияния метаболических путей на разных этапах течения алкогольной зависимости.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований установлено, что ранний период постабстинентного состояния у больных с алкогольной зависимостью сопровождается выраженным окислительным стрессом с накоплением в крови продуктов окислительной модификации белков и липидов.

Выявлены взаимосвязи маркеров ОС с давностью заболевания, возрастом формирования алкогольного абстинентного синдрома, продолжительностью ААС. Обнаружены корреляции между КБ, ТБК-РП, 8-OH-dG и провоспалительными цитокинами, концентрация которых статистически значимо повышена у пациентов с АЗ.

В совокупности показано, что исследуемые периферические биомаркеры отражают интегративный вклад окислительного стресса и воспаления в патогенез алкогольной зависимости. Полученные результаты расширяют имеющиеся знания о патогенезе алкоголизма и могут быть применены при разработке новых методов лечения пациентов с дополнительным включением препаратов, действие которых направлено на нормализацию оксидативного статуса и снижение процессов воспаления.

Вклад авторов. В.Д. Прокопьева, Т.П. Ветлугина, Н.А. Бохан – концепция и руководство работой; Е.В. Епимахова, А.С. Бойко – проведение экспериментов; В.Д. Прокопьева, Т.П. Ветлугина, Е.В. Епимахова – обсуждение результатов исследования и написание текста; Т.П. Ветлугина, Н.А. Бохан – редактирование текста статьи.

Финансирование. Исследование выполнено за счет бюджетного финансирования ГЗ № 075-00712-24-00, тема НИР № 122020200053-1.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в финансовой или какой-либо иной сфере.

Соблюдение этических норм. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием людей, соответствуют этическим стандартам национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие. Исследование одобрено Локальным этическим комитетом при НИИ психического здоровья Томского НИМЦ (протокол № 147 от 22 ноября 2021 г., дело № 147/5.2021).

作者简介

V. Prokopieva

Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences

编辑信件的主要联系方式.
Email: valyaprok@mail.ru
俄罗斯联邦, 634014, Tomsk

T. Vetlugina

Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences

Email: valyaprok@mail.ru
俄罗斯联邦, 634014, Tomsk

E. Epimakhova

Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences

Email: valyaprok@mail.ru
俄罗斯联邦, 634014, Tomsk

A. Boyko

Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences

Email: valyaprok@mail.ru
俄罗斯联邦, 634014, Tomsk

N. Bokhan

Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences; Tomsk State University

Email: valyaprok@mail.ru
俄罗斯联邦, 634014, Tomsk; 634050, Tomsk

参考

补充文件