The Role of MMP-2 and MMP-9 in the Relationship of Inflammation, Fibrosis and Apoptosis During the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease and the Diagnostic Significance of the Plasma Level of Their Active Forms

Texto integral

Принятые сокращения: ВКМ – внеклеточный матрикс; ЗКП – звездчатые клетки печени; ИГА – индекс гистологической активности; ИЛ – интерлейкин; рИЛ-6Р – растворимый ИЛ-6-рецептор; ИМТ – индекс массы тела; ЛПК – лейкоциты периферической крови; ЛПНП и ЛПВП – липопротеины низкой и высокой плотности; ММП – матриксные металлопротеиназы; НАЖБП – неалкогольная жировая болезнь печени; НАСГ-СА, -УА и -ВА – неалкогольный стеатогепатит слабой, умеренной и высокой активности; ОХС – общий холестерин; СП – стеатоз печени; СРБ – С-реактивный белок; ТГ – триглицериды; ТИМП – тканевой ингибитор металлопротеиназы; ФНОα – фактор некроза опухоли альфа; ФЦК-18 – фрагменты цитокератина-18; MCP-3 – хемоаттрактантный белок-3.

ВВЕДЕНИЕ

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) представляет собой широко распространенное хроническое, медленно прогрессирующее метаболическое мультифакториальное заболевание, которое является самым частым хроническим заболеванием печени в развитых странах [1]. По последним данным, распространенность НАЖБП в мире составляет 29–35% среди взрослого населения [2, 3] и продолжает быстро расти [4]. В России НАЖБП также является чрезвычайно распространенным хроническим заболеванием печени во взрослой популяции. Согласно последнему анализу мультицентровых исследований, обобщенная распространенность НАЖБП в России составляет около 32% [5]. Сложные патогенетические механизмы НАЖБП включают в себя липотоксичность вследствие избыточного накопления липидов в печени, развитие инсулинорезистентности, воспаления, гибели гепатоцитов и фиброза и отличаются стадийностью течения от стеатоза к стеатогепатиту и циррозу печени [6–9]. В настоящее время патогенез прогрессирования НАЖБП объясняется теорией «множественных ударов» (multiple hit hypothesis), согласно которой на генетически предрасположенных к НАЖБП лиц синергетически действует множество факторов (резистентность к инсулину, выработка адипокинов, факторы питания, микробиом кишечника и другие), ряд разнообразных параллельных процессов способствуют развитию стеатоза и воспаления печени [10–12]. Под воздействием диетических, экологических факторов, ожирения нарушается липидный обмен (повышается уровень свободных жирных кислот и холестерола) [13, 14] и развивается инсулинорезистентность [15], формируется дисфункция и усиливается пролиферация адипоцитов [16], а также происходят изменения в кишечном микробиоме [17]. Гиперинсулинемия, вызванная резистентностью к инсулину, приводит к стеатозу за счет увеличения липогенеза в печени de novo [13], снижения окисления свободных жирных кислот и секреции липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) в печени и увеличения оттока свободных жирных кислот из-за усиления липолиза из жировой ткани [18]. После развития стеатоза печень становится более уязвимой для «множественного воздействия», включая бактериальные токсины кишечного происхождения, дисбаланс адипокинов/цитокинов, митохондриальную дисфункцию, окислительное повреждение, нарушение регуляции апоптоза гепатоцитов, высвобождение профиброгенных факторов и провоспалительных медиаторов из поврежденных органелл и активацию звездчатых клеток печени (ЗКП) и клеток Купфера [7, 16]. Действующие многочисленные факторы могут совместно стимулировать воспаление, апоптоз и фиброз, что в конечном итоге приводит к прогрессированию НАЖБП (к НАСГ и циррозу печени) [16]. Согласно стадиям, выделяют ряд клинико-морфологических форм НАЖБП: стеатоз, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) (с фиброзом или без) и цирроз печени [19, 20]. НАСГ представляет собой воспалительную инфильтрацию паренхимы и стромы печени с наличием балонной дистрофии гепатоцитов и очаговых некрозов и является промежуточным и центральным звеном среди последовательных стадий одного патологического процесса (неалкогольного стеатоза и неалкогольного стеатофиброза). Стеатоз печени (СП) – ранняя форма НАЖБП, характеризующаяся доброкачественным клиническим течением, тогда как НАСГ отличается прогрессирующим течением. Фиброз при НАСГ ассоциирован с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний, злокачественных новообразований и смертности при НАСГ [19, 21]. Ключевые проблемы диагностики НАЖБП – дифференциация НАСГ от простого стеатоза, выявление фиброза печени и поиск малоинвазивных альтернатив биопсии печени, которая имеет серьезные ограничения и может не отражать истинной картины повреждения, воспаления и фиброза вследствие малого объема ткани [22]. Кроме того, острой проблемой диагностики НАЖБП является консенсус относительно определения НАЖБП и диагностических критериев [23, 24]. В настоящий момент идет обсуждение по поводу замены термина «НАЖБП» на термин «МАЖБП» – метаболически ассоциированная жировая болезнь печени (жировая болезнь печени, связанная с метаболической дисфункцией) [25, 26]. Считается, что, в отличие от НАЖБП, МАЖБП представляет собой «активный» диагноз, основанный на наличии избыточного веса/ожирения или, у худощавых субъектов, на сочетании метаболических дисфункций, которые действуют как факторы высокого риска [23]. Сложность патогенеза НАЖБП, широкая распространенность, ограничения биопсии печени и отсутствие согласия в отношении номенклатуры и диагностических критериев обусловливают глубокий интерес к поиску малоинвазивных биомаркеров диагностики и прогрессирования НАЖБП.

Фиброз является одним из важных компонентов прогрессирования хронических патологий печени, в том числе НАЖБП [27]. Фиброз печени характеризуется избыточным накоплением компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) в субэндотелиальном пространстве Диссе и в интерстиции, в портальных трактах [28]. В основе развития и прогрессирования фиброза лежит нарушение баланса между процессом фиброгенеза (отложением ВКМ, обусловленным активацией ЗКП и их трансдифференцировкой в продуцирующие ВКМ миофибробласты) и антифибротическими процессами: фибролизисом (деградацией ВКМ [29]), а также инактивацией или апоптозом миофибробластов [30, 31]. Избыточное отложение ВКМ в процессе фиброгенеза приводит к изменениям содержания и состава компонентов ВКМ (ремоделированию ВКМ), что обусловливает изменение его свойств (в том числе повышение жесткости) и способствует возникновению и развитию фиброза печени [32]. В случае фиброзов вообще и печени в частности отмечается не только избыточный синтез измененного матрикса, но также нарушение процессов его разрушения [33]. Одними из ключевых медиаторов ремоделирования ВКМ являются матриксные металлопротеиназы (ММП) [34], в связи с чем они рассматриваются в качестве терапевтических мишеней при лечении хронических заболеваний печени [29]. ММП регулируют состав ВКМ печени, наиболее важные структурные компоненты которого: коллаген I, III, IV, V, VI типов, протеогликаны, ламинин, фибронектин и другие белки [35, 36]. ММП представляют собой семейство высокогомологичных мультидоменных внеклеточных кальций-зависимых цинксодержащих эндопротеиназ, гидролизующих коллаген и другие компоненты ВКМ [29]. ММП различаются по структурной и субстратной специфичности, в частности, ММП-2 и ММП-9 формируют группу желатиназ. ММП-2 обладает свойством как стимулировать фиброз [29, 37], так и снижать его [29, 38–40]. Что касается ММП-9, в настоящее время есть свидетельства ее антифиброзных свойств [41–43], однако нет четких данных о прямом участии ММП-9 в развитии фиброза печени. ММП-9 способна косвенно стимулировать фиброз, но никак не коррелирует с ним [44, 45]. Основными субстратами желатиназ являются частично денатурированный коллаген (желатин), различные нативные типы коллагенов, в том числе коллаген типа IV, образующий базальную мембрану эндотелия, фибронектин, эластин, интерлейкин-1β (ИЛ-1β) и TGF-β. Кроме того, для ММП-2 субстратом является про-ММП-9 [45]. Путем процессинга цитокинов и хемокинов желатиназы осуществляют регуляцию воспаления [46].

Желатиназы играют важную роль в патогенезе хронических заболеваний печени, участвуя в процессах воспаления и фиброза. Они могут проявлять как провоспалительное (ММП-2, ММП-9) [47–51], так и противовоспалительное (ММП-2) действие [47, 52–54]. Согласно данным зимографии in situ, в гепатоцитах фиброзной печени человека и мыши содержание и активность MMП-2 и -9 увеличивались и положительно коррелировали с тяжестью фиброза [55]. ММП-2 в фиброгенезе печени обладает антифиброзным [29, 38–40] и профибротическим [29, 37] потенциалом, а ММП-9 проявляет главным образом антифиброзные свойства [41–43], при этом есть некоторые доказательства ее косвенного участия в развитии фиброза печени [44, 45].

ММП-2 (желатиназа A, EC 3.4.24.24, 72 кДа) экспрессируется различными клетками печени (ЗКП, фибробластами, клетками Купфера), нейтрофилами, макрофагами и моноцитами [29, 47]. Есть свидетельства того, что уровень ММП-2 относительно постоянен и обычно не подвержен влиянию цитокинов или факторов роста [56]. В ряде исследований отмечена связь экспрессии ММП-2 с хроническим гепатитом C [57], фиброзом печени [58], алкогольным циррозом печени [59], ишемией и реперфузионным повреждением [60], гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК) [61]. ММП-2 проявляет антифиброзные свойства. Согласно данным Radbill et al. [39], при CCl4-индуцированном фиброзе у мышей с дефицитом ММП-2 (Mmp2–/–) развивался гораздо более значительный фиброз печени, чем у мышей дикого типа (Mmp2+/+). Кроме того, в культуральном эксперименте было показано, что ММП-2 подавляет экспрессию коллагена α1(I) активированными ЗКП [39]. Авторы считают, что повышение уровня ММП-2 во время прогрессирования фиброза печени может быть важным механизмом ингибирования синтеза коллагена I типа активированными ЗКП, обеспечивая тем самым защитную, а не патологическую роль. Onozuka et al. [40] показали, что дефицит ММП-2 ускоряет фиброз, индуцированный CCl4 и холестазом, за счет активации ЗКП. Было показано, что ММП-2 способна подавлять активацию тканевого ингибитора металлопротеиназ 1 (ТИМП-1) при фиброзе печени [40]. Помимо антифиброзных свойств, ММП-2 обладает свойством стимулировать фиброз печени [29, 37, 62]. Есть данные, полученные in vitro и свидетельствующие о том, что активная ММП-2 является аутокринным регулятором пролиферации ЗКП [62].

Накоплены сведения, подтверждающие противовоспалительную роль ММП-2. Дефицит ММП-2 у мышей и человека вызывает сложный метаболический и воспалительный синдром, включающий сердечную дисфункцию, артрит, потерю костной массы, липодистрофию и задержку роста [52]. Показано, что ММП-2 расщепляет моноцитарный хемоаттрактантный белок-3 (MCP-3). Расщепленный MCP-3 связывается с CC-хемокиновыми рецепторами (CCR1, CCR2 и CCR3), действуя как общий антагонист хемокинов, что приводит к уменьшению миграции иммунных клеток в места повреждения и снижению уровня воспаления [53]. Известно, что провоспалительный цитокин ИЛ-1β индуцирует продукцию ММП-2 клетками соединительной ткани, активированная ММП-2, в свою очередь, отрицательно регулирует активность ИЛ-1β посредством его деградации [54]. Помимо реализации противовоспалительных эффектов, ММП-2 может также выступать в роли медиатора воспаления, проявляя провоспалительные свойства. Показано, что ММП-2 опосредованно участвует в инфильтрации лейкоцитов в ткани при воспалении, расщепляя большой эндотелин-1 (ET-1) с образованием нового пептида из 32 аминокислот – ET-1(1–32). ET-1(1–32) связывается с рецептором эндотелина А, приводя к снижению экспрессии L-селектина и активации интегрина CD11b/CD18 на поверхности нейтрофилов, что способствует адгезии лейкоцитов к эндотелиальным клеткам и транспорту нейтрофилов в воспаленные ткани [50].

ММП-9 (желатиназа B, EC 3.4.24.35, 92 кДа) секретируется многими типами клеток, в том числе моноцитами, лейкоцитами, макрофагами и фибробластами [29, 63]. Базальные уровни ММП-9 обычно низки, ее экспрессия может индуцироваться цитокинами/хемокинами, включая ФНОα [56]. Показано, что индукция НАСГ у мышей приводит к повышению уровня мРНК гена Mmp9 в печени и содержания ММП-9 в крови [64]. Повышенная экспрессия ММП-9 выявлена при фиброзе печени [55], алкогольном циррозе печени [59] и ГЦК [65]. ММП-9 оказывает антифиброзное действие. Известно, что ММП-9 активирует апоптоз ЗКП в культуре [41]. Melgar-Lesmes et al. [42] показали, что внедрение плазмиды, сверхэкспрессирующей ММП-9, в воспалительные макрофаги цирротической печени приводит к переключению макрофагов с воспалительного (М1) на прорегенеративный (М2) тип и способствует локальному разрешению фиброза. Feng et al. [43] с использованием модели фиброза, индуцированного тиоацетамидом у грызунов, получили доказательства того, что ММП-9, полученная из клеток Купфера, играет решающую роль в разрешении фиброза печени. Несмотря на свидетельства участия ММП-9 в развитии легочного фиброза [66], прямых доказательств профибротической роли ММП-9 в печени практически нет. Показано, что нокаут гена Mmp9 у мышей приводит к ослаблению фиброгенеза [44], но также наблюдается замедленная реакция регенерации печени после частичной гепатэктомии [67] по сравнению с контрольными животными дикого типа. Известно, что ММП-9 может активировать латентный TGF-β в процессе протеолитического расщепления [68]. Kaviratne et al. [69] изучали роль TGF-β в ИЛ-13-зависимом фиброзе печени, вызванном инфекцией Schistosoma mansoni. Было продемонстрировано, что нокаут гена, кодирующего MMP-9 у мышей, не влияет на фиброз даже при хронической инфекции [69].

ММП-9 участвует в процессах воспаления, ремоделирования тканей и репарации, мобилизации матрикссвязанных факторов роста и процессинге цитокинов [29, 47]. Накоплены данные о провоспалительной роли ММП-9. Показано, что у Mmp9 –/–-мышей с экспериментально вызванным стеатозом наблюдается снижение инфильтрации лейкоцитов в печень, экспрессии провоспалительных цитокинов и некроза печени по сравнению с контрольными животными [48]. Снижение активности ММП-9 вследствие дефицита индуцибельной синтазы оксида азота нарушает миграцию лейкоцитов в печень и снижает уровень воспаления при повреждении печени, вызванном ишемией/реперфузией [49]. Так же, как и ММП-2, ММП-9 участвует в регуляции экспрессии молекул адгезии на поверхности нейтрофилов посредством расщепления эндотелина-1 (ET-1), что способствует миграции лейкоцитов к очагу воспаления [50]. Показано, что ММП-9 активирует провоспалительные цитокины ФНОα и ИЛ-1β [51, 70].

Таким образом, ММП-2 и ММП-9 участвуют в процессах воспаления и фиброза и играют важную роль в патогенезе хронических заболеваний печени. Прогрессирование печеночно-клеточной недостаточности при НАЖБП напрямую связано с утратой паренхимы вследствие инфильтрации лейкоцитов и запуском иммуновоспалительных процессов, поэтому есть основания рассматривать уровень ММП-2 и -9 в крови и профиль экспрессии кодирующих генов в лейкоцитах периферической крови (ЛПК) в качестве маркеров прогрессирования и диагностики НАЖБП, однако имеющиеся данные единичны, противоречивы и касаются в основном НАСГ высокой активности [71]. Кроме того, поскольку фиброгенетическая активность и ремоделирование ВКМ при НАЖБП являются типичными изменениями на поздних стадиях, внимание исследователей в основном сосредоточено на изучении роли ММП и их тканевых ингибиторов на стадиях НАЖБП с продвинутым фиброзом [72, 73]. Учитывая провоспалительную роль ММП-9 [48, 49] и в большей степени противовоспалительную роль ММП-2 [47, 52, 53] при неинфекционных патологиях печени, можно ожидать, что уровень данных металлопротеиназ может быть связан с наличием и активностью воспаления в паренхиме печени, в том числе на ранних стадиях патогенеза НАЖБП.

При прогрессировании НАЖБП имеет место тесная взаимосвязь процессов фиброза, воспаления и апоптоза [6, 74–76], и роль ММП в интеграции этих процессов мало изучена. Ранее мы показали, что цитокиновый профиль и уровни некоторых показателей апоптоза в крови пациентов различаются в зависимости от формы НАЖБП, и получили косвенные подтверждения связи воспаления при развитии НАСГ с процессом каспазозависимого апоптоза ЛПК [77, 78]. В свою очередь, экспрессия и активность ММП регулируются через сигнальные пути, опосредующие воспаление. Так, сигнальный путь ADAM17/TNFα/NF-κB опосредует экспрессию MMP9 в эпителиальных клетках легких [79]. ADAM17 является металлопротеиназой, осуществляющей протеолитическое высвобождение мембранной формы ФНОα, одного из основных провоспалительных цитокинов [80]. Кроме того, известно, что при НАЖБП связь воспаления и фиброза реализуется через NLRP3-инфламмосому [81]. Делеция Nlrp3, кодирующего один из основных компонентов NLRP3-инфламмасомы, у мышей с индуцируемым НАСГ и фиброзом приводит к защите от фиброза печени, снижению содержания мРНК генов Mmp2 и Col1a1 (гена коллагена I типа) по сравнению с мышами дикого типа [81]. Накапливаются сведения об участии ММП-группы желатиназ в процессах регенерации и апоптоза. Например, показано, что у Mmp9–/–-мышей ослаблена регенерация печени после частичной гепатэктомии, снижен уровень апоптоза гепатоцитов и экспрессия активной формы каспазы 3 [67].

На основании вышеизложенного можно заключить, что сведения о роли ММП-2 и ММП-9 в патогенезе НАЖБП, особенно ранних ее форм, противоречивы и недостаточны. Пристального внимания требует вопрос изучения места ММП в реализации связи процессов воспаления, апоптоза и фиброза при прогрессировании НАЖБП. Остается открытым вопрос о диагностической ценности уровней ММП-2 и -9 и мРНК кодирующих генов в периферической крови в диагностике и разграничении разных форм НАЖБП. В связи с этим цель данного исследования – сравнительный анализ уровней ММП-2 и -9 в плазме крови и мРНК кодирующих генов (MMP2, MMP9) в ЛПК пациентов с разными формами НАЖБП на доцирротической стадии (стеатозом печени и НАСГ разной активности без выраженного фиброза), а также оценка корреляционных связей между уровнем ММП-2, ММП-9 в плазме крови и уровнями мРНК генов ADAM17, NLRP3 в ЛПК, провоспалительных цитокинов (ФНОα, ИЛ-6 и его растворимого рецептора) и маркеров апоптоза (специфического маркера апоптоза гепатоцитов – фрагментов цитокератина-18 (ФЦК-18) и активностью каспазы 3) в плазме крови пациентов с НАЖБП изучаемых групп.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Группы исследования. В исследование были включены 95 больных НАЖБП с установленным впервые диагнозом: 26 пациентов со стеатозом печени (СП), 69 пациентов с НАСГ слабой (НАСГ-СА), умеренной (-УА) и высокой (-ВА) активности. Контрольную группу составили 35 здоровых доноров (без клинических проявлений НАЖБП). Клинико-лабораторная характеристика групп исследования представлена в табл. 1.

 

Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика исследуемых групп

Показатель		Контроль (n = 35)	СП (n = 26)	НАСГ-СА (n = 23)	НАСГ-УА (n = 35)	НАСГ-ВА (n = 11)
Возраст, годы		44,42 ± 1,09	47,65 ± 1,48	44,05 ± 1,60	45,09 ± 1,55	48,70 ± 2,59
		(44,00)	(49,00)	(44,50)	(44,50)	(49,00)
Пол	мужской	17	14	13	20	6
	женский	18	12	10	15	5
ИГА, баллы			3,08 ± 1,17	5,00 ± 0,00	6,77 ± 0,14	9,46 ± 0,21
			(3,00)	(5,00)#	(7,00)#,◊	(9,00)#,◊,∆
АЛТ, Ед./литр		17,79 ± 1,03	20,27 ± 1,31	49,81 ± 5,90	85,16 ± 9,31	214,20 ± 76,03
		(17,10)	(21,70)	(47,75)*,#	(68,70)*,#,◊	(135,00)*,#,◊,∆
АСТ, Ед./литр		19,92 ± 0,73	20,95 ± 0,95	36,91 ± 3,86	53,17 ± 5,18	119,20 ± 25,34
		(19,05)	(19,85)	(34,95)*,#	(44,10)*,#	(91,10)*,#,◊,∆
Билирубин общий, мкмоль/литр		14,95 ± 1,37	13,44 ± 1,36	15,98 ± 1,41	19,49 ± 2,23	22,02 ± 1,86
		(13,30)	(12,20)	(16,70)	(16,00)#	(20,65)*,#
ЩФ, Ед./литр		113,30 ± 13,92	159,40 ± 15,06	205,80 ± 14,59	207,00 ± 14,61	320,60 ± 52,77
		(110,00)	(186,50)	(206,10)*	(200,00)	(253,50)*,#
СРБ, мг/литр		0,27 ± 0,15	0,64 ± 0,23	3,17 ± 0,75	2,57 ± 0,58	5,45 ± 0,89
		(0,00)	(0,50)	(3,50)*	(2,50)*	(5,00)*,#
СОЭ, мм/ч		6,69 ± 1,06	7,77 ± 0,85	5,95 ± 1,25	14,21 ± 1,91	14,91 ± 2,77
		(5,00)	(6,50)	(4,00)	(10,00)*,◊	(15,00)*,◊
Лейкоциты, *109/литр		6,14 ± 0,26	6,35 ± 0,41	6,03 ± 0,24	6,12 ± 0,32	6,40 ± 0,43
		(5,80)	(5,70)	(5,70)	(5,95)	(6,39)
Альбумин, г/литр		42,48 ± 1,38	42,65 ± 1,10	40,13 ± 1,31	39,98 ± 1,21	40,71 ± 1,89
		(42,20)	(42,50)	(38,60)	(40,45)	(38,85)
Глюкоза, ммоль/литр		5,16 ± 0,08	5,19 ± 0,11	5,27 ± 0,12	5,39 ± 0,11	5,44 ± 0,23
		(5,06)	(5,20)	(5,25)	(5,50)	(5,50)
ОХС, ммоль/литр		5,04 ± 0,15	5,29 ± 0,19	6,05 ± 0,25	6,08 ± 0,30	6,41 ± 0,38
		(5,09)	(5,29)	(6,10)*	(6,00)*	(6,20)*
ЛПВП, ммоль/литр		1,42 ± 0,09	1,22 ± 0,010	1,27 ± 0,08	1,22 ± 0,10	1,00 ± 0,07
		(1,29)	(1,09)	(1,12)	(1,15)	(1,04)*
ЛПНП, ммоль/литр		3,10 ± 0,16	2,93 ± 0,22	3,66 ± 0,27	3,94 ± 0,22	4,53 ± 0,29
		(3,32)	(2,70)	(3,77)#	(4,00)*,#	(4,40)*,#
ТГ, ммоль/литр		1,33 ± 0,12	1,82 ± 0,21	2,29 ± 0,27	2,21 ± 0,24	2,69 ± 0,71
		(1,25)	(1,64)	(1,96)*	(1,83)*	(2,11)*
FIB-4		0,83 ± 0,06	1,32 ± 0,13	1,11 ± 0,09	1,25 ± 0,08	1,53 ± 0,21
		(0,82)	(1,18)*	(0,99)	(1,18)*	(1,13)*
APRI		0,22 ± 0,02	0,28 ± 0,03	0,42 ± 0,05	0,57 ± 0,06	0,76 ± 0,13
		(0,20)	(0,26)	(0,42)*	(0,52)*,#	(0,57)*,#
ИМТ, кг/м2		24,94 ± 1,21	33,49 ± 1,83	31,75 ± 0,66	33,69 ± 1,14	33,92 ± 1,58
		(24,79)	(33,20)*	(32,00)*	(34,90)*	(34,31)*
ФЦК-18, Ед./литр		81,48 ± 9,31	141,90 ± 14,87	216,80 ± 33,62	304,70 ± 40,35	614,40 ± 162,50
		(77,05)	(141,00)*	(162,20)*	(295,50)*	(520,00)*,#,◊

Примечание. Данные представлены в виде M ± m. В скобках – медиана. Достоверное отличие (p < 0,005) от контроля (*), группы СП (#), группы НАСГ-СА (◊), группы НАСГ-УА (∆) (U-критерий Манна–Уитни с поправкой Бонферрони).

 

Обследование пациентов и здоровых доноров проводилось на базе терапевтического отделения ЧУЗ КБ «РЖД-медицина» (г. Петрозаводск). Диагноз НАЖБП c оценкой степени активности НАСГ устанавливался на основании традиционных клинических, лабораторных, инструментальных и гистологических данных, согласно клиническим рекомендациям Российского общества по изучению печени, Российской гастроэнтерологической ассоциации, Российской ассоциации эндокринологов, Российской ассоциации геронтологов и гериатров и Национального общества профилактической кардиологии по диагностике и лечению НАЖБП [19]. Все пациенты имели признаки метаболического синдрома: индекс массы тела (ИМТ) более 30 кг/м2; окружность талии у мужчин более 102 см, у женщин – более 88 см; дислипидемия в виде увеличения уровня липопротеинов низкой плотности более 3,0 ммоль/литр; систолическое артериальное давление ≥130 мм рт. ст.; диастолическое – ≥80 мм рт. ст. Из исследования исключали пациентов с сахарным диабетом 1-го и 2-го типов. У всех пациентов при абдоминальной сонографии на аппарате Vivid Pro-7 («General Electric», США) отмечалось усиление эхогенности печени, превышающее эхогенность правой почки. Исключали из исследования пациентов с серологическими признаками вирусной HBV-, HCV-гепатотропной инфекции, алкогольной, аутоиммунной и лекарственной этиологией поражения печени. Исключали пациентов с циррозом печени с признаками портальной гипертензии – асцитом, варикозным расширением вен пищевода и кардиального отдела желудка, расширением диаметра воротной вены и селезеночной вены и замедлением линейной скорости кровотока по данным венам при допплерографии. Для части больных выполнялась спиральная компьютерная томография печени с оценкой плотности печени. Всем пациентам выполняли слепую чрескожную биопсию печени, на основании которой верифицировалась форма НАЖБП: стеатоз без воспаления и баллонной дистрофии гепатоцитов или стеатогепатит разной активности в зависимости от выраженности гепатоцеллюлярной баллонной дегенерации, долькового и портального воспаления (в основном лимфоцитарного с некоторым количеством нейтрофилов) и степени макровезикулярного стеатоза гепатоцитов – по методу Brunt et al. [82]. Согласно данному методу, выделяют три степени гистологической активности НАСГ: слабую (легкую), умеренную и высокую (тяжелую); слабая гистологическая активность НАСГ соответствует минимальным критериям для диагностики стеатогепатита с некоторой степенью гепатоцеллюлярного стеатоза и характерным дольковым смешанным воспалением. Индекс гистологической активности (ИГА) представлен в табл. 1. По результатам гистологического анализа биоптатов среди включенных в исследование пациентов НАСГ определяли 1- и 2-стадии фиброза печени (F1–F2), отсутствовали пациенты с выраженным фиброзом. От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие. Критерии исключения, общие для изучаемых групп: перенесенные в последний месяц инфекционно-воспалительные заболевания, беременность и лактация, курение. На проведение исследований получено согласие комитета по медицинской этике Министерства здравоохранения Республики Карелия и Петрозаводского государственного университета (протокол № 48 от 10 марта 2023 г.).

Материал исследования. В качестве материала для исследования использовали образцы венозной крови доноров изучаемых групп. Взятие материала проводили до назначения гепатопротекторной и иной терапии.

Определение клинико-лабораторных показателей крови. На автоматических анализаторах Random Access А-15 и А-25 («BioSystems», Испания) был проведен общий клинический анализ крови и определение следующих биохимических показателей крови: активности аланинаминотрансферазы (АЛАТ) и аспартатаминотрансферазы (АСАТ) кинетическим УФ-методом «АЛТ-УФ и АСТ-УФ – новая жидкая форма»; билирубина колориметрическим методом «Билирубин-Ново»; щелочной фосфатазы (ЩФ) кинетическим методом «Щелочная фосфатаза-Ново (жидкая форма)»; альбумина фотометрическим методом «Альбумин-Ново»; С-реактивного белка (СРБ) иммунотурбидиметрическим методом «СРБ-Ново»; общего холестерина (ОХС) ферментативным методом «Холестерин-Ново»; триглицеридов (ТГ) ферментативным колориметрическим методом «Триглицериды-Ново» (жидкая форма); глюкозы глюкозооксидазным методом «Глюкоза-Ново». Перечисленные реактивы были производства фирмы «Вектор-Бест», Россия. Липопротеины низкой плотности (ЛПНП) определяли расчетным методом по формуле Фридвальда [83]; липопротеины высокой плотности (ЛПВП) – ферментативным методом «Липопротеиды высокой плотности» («BioSystems», Испания). Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) оценивалась методом Вестергрена.

Определение индексов фиброза FIB-4 и APRI. FIB-4 рассчитывали по формуле (1) [84]:

$\frac{\left[возраст(г.) \times АСТ\left(\frac{Ед.}{литр}\right)\right]}{\left[тромбоциты\left(\frac{{10}^9}{литр}\right)\times \sqrt{АЛТ}\left(\frac{Ед.}{литр}\right)\right]}$. (1)

При значении индекса FIB-4 ≥ 2,67 с достоверностью 80% можно утверждать о высоком риске прогрессирования фиброза; при уровне FIB-4 ≤ 1,30 с достоверностью 90% – о низком риске [85].

Индекс APRI рассчитывали по формуле (2) [86]:

$\frac{\left[АСТ\left(\frac{Ед.}{литр}\right)/верхний предел нормы АСТ\left(\frac{Ед.}{литр}\right)\right]}{тромбоциты\left(\frac{{10}^9}{литр}\right)}\times 100$. (2)

При значении индекса APRI ≤ 0,50 вероятность фиброза печени низка; при уровне APRI ≥ 1,50 – с высокой вероятностью можно говорить о выраженном фиброзе печени [87, 88].

Определение уровня мРНК генов MMP2, MMP9, ADAM17, NLRP3 в ЛПК. Для определения уровня транскриптов генов из цельной крови выделяли ЛПК здоровых доноров и пациентов с НАЖБП (величина выборок указана в табл. 1) методом, основанным на способности изотонического раствора хлорида аммония гемолизировать эритроциты [89]. Тотальную РНК из ЛПК выделяли с помощью реагента ExtractRNA («Евроген», Россия). Первую цепь комплементарной ДНК синтезировали из тотальной РНК с помощью набора MMLV RT kit («Евроген»). Степень чистоты и концентрацию кДНК определяли на приборе SmartSpecPlus («Bio-Rad», США). Уровень мРНК генов в ЛПК оценивали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на приборе LightCycler 96 («Roche», Швейцария), используя набор для амплификации с интеркалирующим красителем SYBR Green («Евроген»). Специфичность продуктов амплификации проверяли плавлением ПЦР-фрагментов. Повторность при ПЦР-анализе – 3-кратная. Уровень транскриптов изучаемых генов был рассчитан относительно уровня транскрипции гена 18S rRNA по методу, описанному Livak и Schmittgen [90]. Нуклеотидные последовательности праймеров для ПЦР-РВ указаны в табл. 2, праймеры конструировали в программе Beacon Designer 5.

 

Таблица 2. Нуклеотидные последовательности праймеров

Ген	Прямой праймер, 5′→3′	Обратный праймер, 5′→3′	ПЦР-продукт, п.н.
18S rRNA	agaaacggctaccacatcca	caccagacttgccctcca	169
MMP2	gaagagcgtgaagtttggaag	aaggcagtggagaggaagg	90
MMP9	cagagatgcgtggagagtc	aaggcgtcgtcaatcacc	250
ADAM17	gcattctcaagtctccacaag	ctctagcaacatcttcacatcc	110
NLRP3	ggacaatgacagcatcgggt	tggtcagttaatagaaagatagcgg	211

 

ИФА. Методом ИФА в плазме здоровых доноров (n = 21) и пациентов с СП (n = 19), НАСГ-СА (n = 19), НАСГ-УА (n = 19), НАСГ-ВА (n = 11) определяли следующие показатели: матриксная металлопротеиназа 2 (тест-система «Human MMP2 ELISA Kit»; «ELK Biotechnology», Китай); матриксная металлопротеиназа 9 (тест-система «Human MMP9 ELISA Kit»; «ELK Biotechnology»); тканевой полипептид-специфический антиген (фрагменты цитокератина-18 (ФЦК-18) – показатель апоптоза гепатоцитов) (тест-система «TPS ELISA»; «Biotech», Швеция); фактор некроза опухоли альфа (ФНОα) (тест-система «Human TNFα Platinum ELISA»; «eBioscience», Австрия); интерлейкин-6 (ИЛ-6) (тест-система «Интерлейкин-6 – ИФА – Бест»; «Вектор-Бест»); растворимый ИЛ-6-рецептор (рИЛ-6Р) (тест-система «Human sIL-6R ELISA»; «eBioscience»); интерлейкин-8 (ИЛ-8) (тест-система «Интерлейкин-8 – ИФА – Бест»; «Вектор-Бест»).

Определение активности каспазы 3 в ЛПК. Активность каспазы 3 в ЛПК здоровых доноров (n = 26) и пациентов с СП (n = 17), НАСГ-СА (n = 19), НАСГ-УА (n = 17), НАСГ-ВА (n = 9) определяли с использованием набора Caspase 3 Assay Kit, Colorimetric («Sigma-Aldrich», США). Согласно инструкциям производителя, активность каспазы 3 определяли колориметрическим методом по скорости расщепления синтетического субстрата каспазы 3 (N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-Nitroanilide) на планшетном ридере CLARIOstar («BMG Labtech GmbH», Германия) и выражали в нмоль p-нитроанилина (p-NA), образующегося за 1 мин, в расчете на 1 мл пробы (при условии, что 100 мкл лизирующего буфера содержит 107 живых клеток).

Статистический анализ проведен с использованием программы GraphPad Prism v.7. Значения р < 0,05 рассматривались как статистически значимые. Проводили тест на соответствие результатов нормальному распределению (с помощью критерия W Шапиро–Уилка). В связи с несоответствием распределений показателей в группах нормальному использовали непараметрические критерии для анализа. При сравнении изучаемых показателей в группах использовали критерий H Краскела–Уоллиса с последующим парным сравнением групп с помощью критерия U Вилкоксона–Манна–Уитни с применением поправки Бонферрони при оценке значения p. Взаимосвязь показателей оценивали с помощью расчета рангового коэффициента корреляции Спирмена (r_s). Для оценки силы связи между двумя величинами использовали шкалу Чеддока, согласно которой значения r_s от 0,1 до 0,3 соответствуют слабой взаимосвязи, 0,3–0,5 – умеренной, 0,5–0,7 – заметной, 0,7–0,9 – высокой, более 0,9 – весьма высокой. Анализ ROC-кривых проводили по вычислению значений площадей под кривыми (AUC), оптимальный порог отсечения определяли в соответствии с максимальным индексом Юдена [91, 92].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Особенности клинико-лабораторной картины при СП и НАСГ. Нами проведен сравнительный анализ клинико-лабораторных данных здоровых доноров и пациентов с СП и НАСГ разной активности (табл. 1). Согласно данным дисперсионного анализа Краскела–Уоллиса, сравниваемые группы исследования статистически значимо различаются по ИГА (H = 87,99; p < 0,001), уровню АЛТ (H = 83,28; p < 0,001), АСТ (H = 75,46; p < 0,001), общего билирубина (H = 18,66; p < 0,001), ЩФ (H = 25,43; p < 0,001), СРБ (H = 26,06; p < 0,001), СОЭ (H = 24,98; p < 0,001), ОХС (H = 18,68; p < 0,001), ЛПВП (H = 10,93; p = 0,027), ЛПНП (H = 21,42; p < 0,001), ТГ (H = 15,89; p = 0,003), FIB-4 (H = 19,98; p < 0,001), APRI (H = 42,82; p < 0,001), ИМТ (H = 21,02; p < 0,001), ФЦК-18 (H = 37,79; p < 0,001). При этом нет статистически значимых различий между группами по возрасту (H = 5,16; p = 0,271), уровню лейкоцитов (H = 0,48; p = 0,976), альбумина (H = 4,67; p = 0,323) и глюкозы (H = 5,81; p = 0,214) в крови.

Нужно отметить, что включенные в исследование пациенты с НАЖБП отличались от контроля повышенным уровнем ИМТ. Уровень FIB-4 также был выше у пациентов НАЖБП по сравнению со здоровыми людьми, за исключением группы НАСГ-СА, где уровень FIB-4 не отличался от контроля. Уровень APRI у пациентов с НАСГ был выше, чем у здоровых людей. Кроме того, группы пациентов достоверно не различались по FIB-4 и ИМТ, в то время как APRI у пациентов с НАСГ-УА и -ВА превосходил таковой у лиц с простым стеатозом печени. Согласно гистологическим данным, показателям ИМТ, FIB-4 и APRI, среди пациентов не было лиц с выраженным фиброзом и морбидным ожирением (табл. 1).

У пациентов СП рутинные клинико-лабораторные показатели крови не отличаются от контроля. При этом уровень специфического маркера апоптоза (ФЦК-18) у пациентов СП выше, чем у здоровых людей. При переходе от СП к НАСГ и по мере нарастания степени активности НАСГ повышаются маркеры цитолитического и холестатического синдромов (АЛАТ, АСАТ, ЩФ). Что касается маркеров воспаления, уровень СРБ повышен при НАСГ относительно контроля, а также относительно СП (в случае НАСГ-ВА). СОЭ при НАСГ-УА и -ВА выше, чем у здоровых людей и пациентов с НАСГ-СА, и не различается у других групп исследования. Концентрация ФЦК-18 при НАСГ повышена относительно контроля, при этом уровень ФЦК-18 в крови НАСГ высокой активности превышает таковой у пациентов с простым стеатозом (СП) и НАСГ-СА. Уровни ТГ и ОХС остаются нормальными при СП и повышены при НАСГ относительно контроля. Данные свидетельствуют о том, что повышение уровня ОХС происходит главным образом за счет нарастания концентрации ЛПНП (табл. 1).

Уровень ММП-2 и ММП-9 в плазме крови при СП и НАСГ. Согласно данным дисперсионного анализа Краскела–Уоллиса, группы исследования (контрольная, СП, НАСГ-СА, -УА, -ВА) статистически значимо различаются по уровню ММП-2 (H = 15,62; p = 0,004) и ММП-9 (H = 13,38; p = 0,010) в плазме крови. Результаты сравнительного анализа уровней ММП-2 и ММП-9 в плазме крови здоровых людей, пациентов с СП, пациентов с НАСГ разной активности представлены на рис. 1 и рис. 2. Показано, что плазменный уровень ММП-2 при СП ниже, чем у здоровых людей, при этом не обнаружено различий в уровне данного показателя у пациентов с НАЖБП разных групп (СП и НАСГ разной степени гистологической активности) (рис. 1).

 

Рис. 1. Концентрация ММП-2 в плазме крови пациентов с НАЖБП и в контрольной группе. Данные представлены в виде: Q1–Q3, медиана, минимум, максимум. Указаны значения p, согласно U-критерию Манна–Уитни с поправкой Бонферрони

 

Рис. 2. Концентрация ММП-9 в плазме крови пациентов с НАЖБП и в контрольной группе. Данные представлены в виде: Q1–Q3, медиана, минимум, максимум. Указаны значения p, согласно U-критерию Манна–Уитни с поправкой Бонферрони

 

Согласно полученным результатам, уровень ММП-9 в плазме крови пациентов общей группы НАСГ, объединяющей все степени активности, составил (в виде M ± m, в скобках – медиана) 474,5 ± 32,12 (470,3) пг/мл, что достоверно выше, чем у здоровых людей (354,0 ± 44,85 (270,0) пг/мл; p = 0,026) и пациентов СП (337,9 ± 26,69 (318,5) пг/мл; p = 0,018). Показано, что концентрация ММП-9 в плазме крови пациентов с НАСГ-СА значимо выше, чем у здоровых людей, пациентов групп СП и НАСГ-УА (рис. 2). Эти результаты имеют потенциальную клиническую ценность для диагностики ранних форм НАЖБП при отсутствии значимого фиброза.

Для того чтобы оценить значимость плазменных уровней ММП-9 и ММП-2 в качестве диагностического теста для разграничения ранних форм НАЖБП, нами были построены и проанализированы ROC-кривые для данных показателей у пациентов НАСГ-СА относительно пациентов СП. Статистическая достоверность ROC-кривой по концентрации ММП-2 не обнаружена (AUC = 0,681 (95%-ный доверительный интервал 0,509–0,854); p = 0,056). Согласно анализу ROC-кривой для концентрации ММП-9 в плазме пациентов НАСГ-СА относительно пациентов СП, уровень ММП-9 в плазме крови имеет диагностическую значимость для выявления НАСГ-СА среди пациентов с простым стеатозом (рис. 3). В соответствии с расчетом максимального индекса Юдена, оптимальный порог отсечения составляет >389,50 пг/мл ММП-9 в плазме крови (табл. 3).

 

Рис. 3. ROC-кривая для концентрации ММП-9 в плазме пациентов НАСГ-СА относительно пациентов СП. AUC = 0,818 (95%-ный доверительный интервал 0,689–0,948); p < 0,001

 

Таблица 3. Чувствительность, специфичность, отношение правдоподобия положительного результата, индекс Юдена при разных порогах отсечения ROC-кривой для концентрации ММП-9 в плазме пациентов НАСГ-СА относительно пациентов СП

Порог отсечения, пг/мл	Чувствительность (95% ДИ); Se	Специфичность (95% ДИ); Sp	Отношение правдоподобия; LR	Индекс Юдена; J
> 201,3	1,000 (0,832–1,000)	0,050 (0,003–0,236)	1,053	0,050
> 210,1	1,000 (0,832–1,000)	0,200 (0,081–0,416)	1,250	0,200
> 225,3	1,000 (0,832–1,000)	0,250 (0,112–0,469)	1,333	0,250
> 249,2	1,000 (0,832–1,000)	0,300 (0,146–0,519)	1,429	0,300
> 269,4	1,000 (0,832–1,000)	0,350 (0,181–0,567)	1,538	0,350
> 282,4	1,000 (0,832–1,000)	0,400 (0,219–0,613)	1,667	0,400
> 292,4	0,947 (0,754–0,997)	0,400 (0,219–0,613)	1,579	0,347
> 303,3	0,947 (0,754–0,997)	0,450 (0,258–0,658)	1,722	0,397
> 316,1	0,947 (0,754–0,997)	0,500 (0,299–0,701)	1,895	0,447
> 320,6	0,895 (0,686–0,981)	0,500 (0,299–0,701)	1,789	0,395
> 323,0	0,842 (0,624–0,945)	0,500 (0,299–0,701)	1,684	0,342
> 326,5	0,842 (0,624–0,945)	0,550 (0,342–0,742)	1,871	0,392
> 334,6	0,790 (0,567–0,915)	0,550 (0,342–0,742)	1,754	0,340
> 341,4	0,790 (0,567–0,915)	0,600 (0,387–0,781)	1,974	0,390
> 356,4	0,790 (0,567–0,915)	0,650 (0,433–0,819)	2,256	0,440
> 389,5	0,790 (0,567–0,915)	0,700 (0,481–0,855)	2,632	0,490
> 414,5	0,737 (0,512–0,882)	0,700 (0,481–0,855)	2,456	0,437
> 422,1	0,737 (0,512–0,882)	0,750 (0,531–0,888)	2,947	0,487
> 428,1	0,684 (0,460–0,846)	0,750 (0,531–0,888)	2,737	0,434
> 455,3	0,632 (0,410–0,809)	0,750 (0,531–0,888)	2,526	0,382
> 489,0	0,632 (0,410–0,809)	0,800 (0,584–0,919)	3,158	0,432
> 502,0	0,632 (0,410–0,809)	0,850 (0,640–0,948)	4,211	0,482
> 504,1	0,579 (0,363–0,769)	0,850 (0,640–0,948)	3,860	0,429
> 507,2	0,526 (0,317–0,727)	0,850 (0,640–0,948)	3,509	0,376
> 516,4	0,474 (0,273–0,683)	0,850 (0,640–0,948)	3,158	0,324
> 523,0	0,474 (0,273–0,683)	0,900 (0,699–0,982)	4,737	0,374
> 524,2	0,421 (0,231–0,637)	0,900 (0,699–0,982)	4,211	0,321
> 526,4	0,421 (0,231–0,637)	0,950 (0,764–0,997)	8,421	0,371
> 528,4	0,368 (0,192–0,590)	0,950 (0,764–0,997)	7,368	0,318
> 546,2	0,368 (0,192–0,590)	1,000 (0,839–1,000)		0,368
> 583,9	0,316 (0,154–0,540)	1,000 (0,839–1,000)		0,316
> 652,4	0,263 (0,118–0,488)	1,000 (0,839–1,000)		0,263
> 732,8	0,211 (0,085–0,433)	1,000 (0,839–1,000)		0,211
> 882,7	0,158 (0,055–0,376)	1,000 (0,839–1,000)		0,158
> 1011,0	0,105 (0,019–0,314)	1,000 (0,839–1,000)		0,105
> 1218,0	0,053 (0,003–0,246)	1,000 (0,839–1,000)		0,053

Примечание. Жирным шрифтом выделен оптимальный порог отсечения, соответствующий максимальному индексу Юдена. Индекс Юдена (J) равен Se + Sp − 1 [91, 92]; ДИ – доверительный интервал.

 

В связи со сложностью механизмов патогенеза НАЖБП и актуальностью изучения связи процессов воспаления, апоптоза и фиброза при данном заболевании была поставлена задача оценить расширенный комплекс биохимических и молекулярно-генетических показателей у пациентов СП и НАСГ разной активности и провести корреляционный анализ этих показателей с уровнями ММП-9 и ММП-2 в плазме крови. Поскольку при СП и НАСГ биопсия печени возможна в крайне редких случаях, особенно актуален поиск малоинвазивных маркеров НАЖБП, в связи с чем в качестве материала для исследования используют периферическую кровь.

Уровень мРНК генов MMP2, MMP9, ADAM17, NLRP3 в ЛПК. Лейкоциты являются основными клетками, реализующими иммуновоспалительные процессы в печени при НАЖБП, лежащие в основе прогрессирования печеночно-клеточной недостаточности. В настоящем исследовании впервые проведен сравнительный анализ уровней мРНК генов MMP2, MMP9, ADAM17, NLRP3 в ЛПК доноров групп исследования. По результатам дисперсионного анализа Краскела–Уоллиса группы исследования статистически значимо различаются по уровню мРНК генов MMP2 (H = 18,11; p = 0,001), MMP9 (H = 11,91; p = 0,018), ADAM17 (H = 13,81; p = 0,008) и NLRP3 (H = 19,36; p = 0,001) в периферических лейкоцитах.

Показано, что уровень транскриптов гена MMP2 в ЛПК пациентов с СП ниже, чем у здоровых людей и пациентов НАСГ умеренной и высокой активности. При анализе уровня мРНК гена MMP9 в ЛПК доноров исследуемых групп статистически значимых различий не обнаружено. Таким образом, результаты анализа групповых различий в уровнях экспрессии генов MMP2, MMP9 в периферических лейкоцитах (табл. 4) корреспондируют с различиями в концентрациях кодируемых ими ферментов в крови (рис. 1; рис. 3) только в случае уровня ММП2. В плазме крови содержание этого фермента и количество мРНК гена MMP2 в ЛПК у пациентов СП оказались ниже по сравнению с контрольной группой. Уровень транскриптов гена ADAM17 в ЛПК при НАСГ-ВА выше, чем у доноров контрольной группы, НАСГ-СА и НАСГ-УА. Экспрессия гена NLRP3 в периферических лейкоцитах людей с простым стеатозом превышает таковую у доноров всех других групп исследования (табл. 4).

 

Таблица 4. Уровень транскриптов генов MMP2, MMP9, ADAM17, NLRP3 в ЛПК больных НАЖБП и здоровых людей

Показатель	Контроль	СП	НАСГ-СА	НАСГ-УА	НАСГ-ВА
Уровень транскриптов гена MMP2 в ЛПК, отн. ед. × 1000
Медиана	0,125	0,037	0,015	0,137	0,182
Минимум	0,006	0,002	0,001	0,009	0,020
Максимум	0,822	0,078	1,900	3,400	4,910
Межквартильный размах	0,301	0,050	0,252	0,529	2,039
p (при p < 0,005)		0,003*		0,001#	0,001#
Уровень транскриптов гена MMP9 в ЛПК, отн. ед. × 1000
Медиана	0,010	0,014	0,007	0,026	0,031
Минимум	0,002	0,002	0,001	0,007	0,012
Максимум	0,030	0,085	0,051	0,101	0,115
Межквартильный размах	0,013	0,035	0,027	0,061	0,096
p (при p < 0,005)
Уровень транскриптов гена ADAM17 в ЛПК, отн. ед. × 1000
Медиана	0,193	0,154	0,108	0,185	1,180
Минимум	0,008	0,015	0,001	0,013	0,204
Максимум	1,320	2,010	0,676	1,000	5,340
Межквартильный размах	0,452	0,666	0,483	0,481	3,167
p (при p < 0,005)					0,002* 0,002◊ 0,002∆
Уровень транскриптов гена NLRP3 в ЛПК, отн. ед. × 1000
Медиана	0,171	1,595	0,039	0,246	0,047
Минимум	0,034	0,323	0,003	0,008	0,018
Максимум	3,770	11,300	0,983	1,840	0,988
Межквартильный размах	0,329	2,973	0,195	0,759	0,609
p (при p < 0,005)		0,001*	<0,001#	0,002#	0,002#

Примечание. Достоверное отличие от контроля (*), группы СП (#), группы НАСГ-СА (◊), группы НАСГ-УА (Δ) (U-критерий Манна–Уитни с поправкой Бонферрони).

 

Уровень ФНОα, ИЛ-6, рИЛ-6Р, ИЛ-8 в плазме крови и активность каспазы 3 в ЛПК. Согласно результатам дисперсионного анализа Краскела–Уоллиса, группы исследования статистически значимо различаются по уровню ФНОα (H = 24,56; p < 0,001), ИЛ-6 (H = 33,68; p < 0,001), рИЛ-6Р (H = 20,71; p < 0,001) и ИЛ-8 (H = 22,46, p < 0,001) в плазме крови. Кроме того, обнаружены статистически значимые различия между группами по активности каспазы 3 в ЛПК (H = 18,22; p = 0,001).

Показано, что в плазме крови пациентов СП и НАСГ всех степеней активности повышен уровень провоспалительных цитокинов ФНОα, ИЛ-6 и ИЛ-8 относительно контроля, при этом различия в содержании этих цитокинов у разных групп пациентов НАЖБП не зарегистрированы. Уровень рИЛ-6Р в плазме крови при НАСГ-ВА ниже, чем у доноров других групп. Активность каспазы 3 в ЛПК при НАСГ умеренной и высокой активности выше, чем у здоровых людей (табл. 5).

 

Таблица 5. Уровень ФНОα, ИЛ-6, рИЛ-6Р, ИЛ-8 в плазме крови и активность каспазы 3 в ЛПК больных НАЖБП и здоровых людей

Показатель	Контроль	СП	НАСГ-СА	НАСГ-УА	НАСГ-ВА
ФНОα, пг/мл
Медиана	3,52	5,92	5,75	7,13	6,00
Минимум	1,45	3,50	4,17	3,72	4,33
Максимум	8,23	9,00	7,83	9,50	8,67
Межквартильный размах	3,18	4,11	1,73	2,34	2,33
p (при p < 0,005)		0,004*	0,002*	<0,001*	0,002*
ИЛ-6, пг/мл
Медиана	2,00	4,38	5,22	5,07	7,25
Минимум	0,45	0,57	1,75	2,25	1,67
Максимум	9,06	13,96	19,48	14,50	37,00
Межквартильный размах	1,41	6,25	6,63	2,97	13,44
p (при p < 0,005)		0,002*	<0,001*	<0,001*	0,002*
рИЛ-6Р, нг/мл
Медиана	84,92	124,7	122,6	94,15	32,7
Минимум	18	40,61	39,2	24,79	14,36
Максимум	147,7	237,9	203,1	256,9	92,34
Межквартильный размах	73,79	55,30	95,36	120,63	31,83
p (при p < 0,005)					0,004* 0,002# <0,001◊ 0,001∆
ИЛ-8, пг/мл
Медиана	6,54	15,60	13,71	11,65	19,57
Минимум	1,97	9,57	3,00	5,14	4,71
Максимум	13,87	24,14	36,29	66,43	64,00
Межквартильный размах	6,38	8,21	21,36	12,54	24,41
p (при p < 0,005)		<0,001*	<0,001*	<0,001*	0,003*
Активность каспазы 3 в ЛПК, нмоль pNA/мин/мл
Медиана	0,448	0,569	0,726	1,029	1,041
Минимум	0,116	0,182	0,460	0,218	0,411
Максимум	1,646	2,759	2,775	2,880	2,880
Межквартильный размах	0,487	0,472	0,428	0,725	1,183
p (при p < 0,005)				0,001*	0,003*

Примечание. Достоверное отличие от контроля (*), группы СП (#), группы НАСГ-СА (◊), группы НАСГ-УА (Δ) (U-критерий Манна–Уитни с поправкой Бонферрони).

 

Корреляционные связи между уровнем ММП-2, ММП-9 и уровнем изучаемых показателей крови. Согласно полученным результатам, уровни ММП-2 и ММП-9 в плазме крови пациентов с НАЖБП и здоровых людей не коррелируют между собой (p > 0,05). Проведен корреляционный анализ уровней ММП-2 и ММП-9 в плазме крови с комплексом изучаемых биохимических и молекулярно-генетических показателей (табл. 6).

 

Таблица 6. Коэффициенты корреляции по Спирмену (r_s) плазменных уровней ММП-2, ММП-9 с уровнем изучаемых показателей крови пациентов НАЖБП и здоровых людей (при p < 0,05)

Показатель	Контроль		СП		НАСГ-СА		НАСГ-УА		НАСГ-ВА
	ММП-2	ММП-9	ММП-2	ММП-9	ММП-2	ММП-9	ММП-2	ММП-9	ММП-2	ММП-9
ИГА								−0,570
АЛТ						−0,538
АСТ
Билирубин общий
ЩФ
СРБ
СОЭ					0,761				0,833
Лейкоциты	0,710
Альбумин
Глюкоза
ОХС
ЛПВП		−0,689
ЛПНП
ТГ								−0,568
APRI						−0,572
FIB-4
мРНК MMP2			0,611
мРНК MMP9
мРНК ADAM17						−0,618
мРНК NLRP3
ФНОα
ИЛ-6
рИЛ-6Р						0,715				0,753
ИЛ-8
ФЦК-18
Активность каспазы 3		0,669						−0,735		−0,754

 

В контрольной группе выявлена сильная связь между уровнем ММП-2 и уровнем лейкоцитов. У пациентов СП концентрация ММП-2 в крови положительно коррелирует с уровнем мРНК гена MMP2 в ЛПК. При НАСГ-СА и -ВА выявлены положительные корреляции заметной и высокой силы уровня ММП-2 с клиническим маркером воспаления (СОЭ) (табл. 6).

У здоровых людей выявлена заметная отрицательная корреляция уровня ММП-9 в плазме крови с содержанием ЛПВП и положительная – с активностью каспазы 3 в ЛПК. У пациентов с НАСГ-СА уровень ММП-9 заметно отрицательно коррелирует с АЛТ, APRI, уровнем мРНК гена ADAM17 в ЛПК и положительно – с содержанием рИЛ-6Р в крови. При НАСГ-УА обнаружена заметная отрицательная связь содержания ММП-9 с ИГА, уровнем ТГ и активностью каспазы 3 в ЛПК. У пациентов НАСГ-ВА выявлена сильная положительная связь плазменных уровней ММП-9 и рИЛ-6Р. Кроме того, при НАСГ-ВА концентрация ММП-9 отрицательно коррелирует с активностью каспазы 3 (табл. 6).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

СП является ранней формой НАЖБП и характеризуется доброкачественным клиническим течением, тогда как НАСГ отличается прогрессирующим течением с возможным развитием цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы [19, 20]. Одной из важных проблем гастроэнтерологии является различение раннего НАСГ от СП, что достаточно сложно сделать на основании изменения рутинных лабораторных показателей, которое может быть неспецифичным для диагностики, что подтверждается результатами проведенного нами сравнительного анализа клинико-лабораторных данных здоровых доноров и пациентов с НАЖБП (СП и НАСГ разной степени гистологической активности) (табл. 1). При стеатозе печени рутинные клинико-лабораторные показатели крови не отличаются от контроля, уровень показателя апоптоза гепатоцитов (ФЦК-18) выше, чем у здоровых людей. НАСГ слабой активности отличается от СП повышенным уровнем аминотрансфераз и ЛПНП. По мере нарастания активности НАСГ закономерно повышается уровень маркеров воспаления, нарастают проявления цитолитического и холестатического синдромов и изменяется липидный профиль. В настоящем исследовании среди пациентов не было людей с выраженным фиброзом печени, при этом были выявлены различия уровней ММП-2 и ММП-9 в плазме крови и мРНК гена MMP2 в ЛПК пациентов разных групп исследования.

Согласно нашим данным, уровень мРНК гена MMP2 в ЛПК (табл. 4) и содержание ММП-2 в плазме крови (рис. 1) снижены у пациентов СП относительно контроля, в остальных случаях групповые различия на уровне экспрессии генов MMP2, MMP9 в периферических лейкоцитах не корреспондируют с различиями в концентрациях кодируемых ферментов в крови. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии однонаправленных изменений в профилях экспрессии генов MMP2 и MMP9 в ЛПК и уровне кодируемых ферментов в плазме в зависимости от формы НАЖБП и степени активности НАСГ, что может быть связано со сложной регуляцией ММП. Известно, что уровень активной формы ММП может регулироваться на уровне транскрипции (экспрессии кодирующих генов) и на уровне механизмов, влияющих на активность фермента (среди них активация зимогена, компартментализация активных протеиназных процессов, связывание с тканевыми ингибиторами металлопротеиназ) [34]. Trojanek et al. [71] провели анализ уровня мРНК генов ММП и их тканевых ингибиторов в ЛПК детей с ультразвуковыми признаками жировой болезни печени и показали, что у детей с НАЖБП уровни мРНК генов MMP9, TIMP2 в ЛПК и концентрация ММП-9 и тканевого ингибитора металлопротеиназ 1 (ТИМП-1) в плазме повышены по сравнению с контрольной группой. Авторы пришли к выводу, что изменения в профилях экспрессии MMP/TIMP в лейкоцитах в основном не связаны с их уровнями в плазме [71]. Cursio et al. [60] на крысиной модели повреждения печени, вызванного ишемией/реперфузией, также показали, что уровень мРНК генов ММП может не соответствовать содержанию активной формы ММП в зависимости от стадии фиброза: экспрессия мРНК гена ММР2 повышалась на всех стадиях повреждения печени, однако активная ММП-2 была обнаружена на более поздних стадиях, во время разрешения фиброза. Авторы показали, что экспрессия гена MMP2, а также генов, кодирующих ММП-14 и ТИМП-2 (необходимых для активации ММП-2), индуцируются с задержкой и длительно при повреждении печени [60]. Авторы отметили, что ранняя индукция ММП после реперфузии способствует повреждению печени и может способствовать гибели клеток. Можем предположить, что при СП действуют механизмы, которые тонко регулируют уровень ММП-2 и -9, не допуская их повышения на первых этапах повреждения печени. Важно, что в нормальной печени уровень ММП сбалансированно регулируется множеством молекул, и нарушение этого баланса вносит вклад в развитие патологии. Например, несбалансированная экспрессия ТИМП и ММП может ускорить или обострить развитие фиброза [93].

Мы выявили снижение ММП-2 при СП, хотя в последующих стадиях НАЖБП отличия от контрольной группы не обнаружено (рис. 1). Уровень транскриптов гена MMP2 в ЛПК пациентов СП ниже, чем у пациентов НАСГ-УА и -ВА (табл. 4). Наши данные позволяют предполагать, что уровень ММП-2 при СП снижается за счет снижения уровня транскрипции гена MMP2, что косвенно подтверждается также данными корреляционного анализа, согласно которым выявлена заметная корреляция между уровнем мРНК гена MMP2 и содержанием ММП-2 в крови при СП (табл. 6). На рис. 4 представлена схема, отражающая предполагаемую связь изменения уровней ММП-2 и -9 и разных стадий НАЖБП. По нашему мнению, снижение уровня ММП-2 в крови именно на стадии простого стеатоза при НАЖБП (в условиях отсутствия выраженного фиброза) объясняется запуском «низкоуровневого воспаления». Низкоуровневое хроническое воспаление (low-grade chronic inflammation) при гепатостеатозе имеет основополагающее значение в прогрессировании НАЖБП. К основным факторам, осуществляющим регуляцию экспрессии различных растворимых провоспалительных медиаторов (цитокинов и хемокинов) и молекул адгезии лейкоцитов при запуске воспаления, относится индуцируемый фактор транскрипции NF-κB [94]. К генам-мишеням NF-κB относятся гены, кодирующие ФНОα, ИЛ-1, ИЛ-6, MCP-1 и другие [95]. Белая жировая ткань является основным жировым депо и крупнейшим эндокринным органом, который системно секретирует адипокины и цитокины. При увеличении пула свободных жирных кислот адипоциты подвергаются аномальному расширению, что приводит к гипоксии и старению, вызванному ремоделированием. В этих условиях адипоциты испытывают стресс эндоплазматического ретикулума, повышается продукция активных форм кислорода. Слабовыраженное хроническое воспаление инициируется и поддерживается с течением времени дисфункциональными адипоцитами, которые секретируют воспалительные адипоцитокины (лептин, резистин, ФНОα, ИЛ-6 и другие), и инфильтрацией иммунных клеток, продуцирующих цитокины и хемокины [96]. Большую роль в процессах низкоуровневого воспаления отводят активированным макрофагам жировой ткани, которые участвуют в воспалительных сигнальных путях, включающих JNK, IKK/NF-κB и JAK/STAT, посредством секреции воспалительных факторов, таких как ФНОα, ИЛ-6, ИЛ-1β и LTB4, тем самым вызывая хроническое воспаление жировой ткани, печени и мышц, что в дальнейшем приводит к резистентности к инсулину [97].

 

Рис. 4. Схема, отражающая предполагаемую связь изменения уровней ММП-2 и -9 и разных стадий НАЖБП. Объяснения в тексте; ↑ – увеличение; ↓ – уменьшение

 

Низкоуровневое воспаление, которое имеет место при простом стеатозе печени, не проявляется гистологически, не отражается в изменениях рутинных клинико-лабораторных показателей крови (табл. 1), однако регистрируется повышение провоспалительных цитокинов (ФНОα, ИЛ-6, ИЛ-8) в крови по сравнению с контролем (табл. 5). Запуск воспалительных процессов на самой ранней стадии патогенеза НАЖБП (СП) подтверждается также повышением экспрессии в периферических лейкоцитах гена NLRP3, кодирующего ключевой компонент NLRP3-инфламмасомы (табл. 4). NLRP3-инфламмасома играет решающую роль в воспалении при НАЖБП, способствуя повреждению печени и фиброзу при развитии НАСГ [81, 98]. Белок NLRP3 (pyrin domain containing protein 3) взаимодействует с апоптоз-ассоциированным белком PYCARD/ASC, содержащим домен рекрутирования каспазы 1, расщепляющей предшественники ИЛ-1β и ИЛ-18 с образованием их биологически активных форм [81]. Как известно, ИЛ-1β индуцирует продукцию ММП-2 клетками соединительной ткани, а активированная ММП-2, в свою очередь, отрицательно регулирует активность ИЛ-1β посредством его деградации [54]. Есть данные о том, что экспрессия гена NLRP3 в печени повышается у мышей с индуцированным стеатозом уже на ранней стадии (при СП), при этом увеличение компонентов NLRP3-инфламмосомы на уровне белка происходит только на стадии НАСГ [99]. Согласно нашим данным, на стадии СП имеет место понижение уровня ММП-2 в крови и повышение уровня транскриптов гена NLRP3 в ЛПК, тогда как при трансформации СП в НАСГ (на стадии НАСГ) концентрация ММП-2 и уровень экспрессии гена NLRP3 не отличаются от группы здоровых людей (рис. 1; табл. 4). Предполагаем, что снижение уровня ММП-2 при СП может приводить к активации/усилению воспаления. В пользу этого выступают данные о противовоспалительных свойствах ММП-2. При дефиците ММП-2 у человека развивается тяжелый воспалительный и метаболический синдром, включающий сердечную дисфункцию, вероятно, за счет избытка сердечной фосфолипазы А2 (сердечная sPLA2). sPLA2 высвобождается из кардиомиоцитов в ответ на моноцитарный хемоаттрактантный белок-3 (MCP-3) [52]. MCP-3 является провоспалительным цитокином, ММП-2 инактивирует MCP-3 расщеплением. Расщепленный MCP-3 связывается с CC-хемокиновыми рецепторами (CCR1, CCR2 и CCR3), действуя как общий антагонист хемокинов [53]. ММП-2 реализует противовоспалительное действие также посредством деградации провоспалительного ИЛ-1β [54]. Согласно нашим данным, при НАСГ наблюдается повышение уровня ММП-2 до уровня контроля и обнаруживается положительная корреляция концентрации ММП-2 в крови с СОЭ у пациентов НАСГ-СА, НАСГ-ВА (сила связи оценивается как высокая) (табл. 6), что может быть связано с трансформацией низкоуровневого воспаления в активное и повышением активности NLRP3-инфламмосомы. Большую роль в реализации этой связи играет ИЛ-1β, который, по данным, полученным нами ранее, повышен при СП и НАСГ относительно контроля и на цирротической стадии НАЖБП достигает максимума [77].

Снижение уровня ММП-2 при стеатозе печени может быть связано не только с запуском провоспалительных механизмов (формированием и поддержанием низкоуровневого воспаления), но и с активацией профибротических механизмов и подавлением продукции ММП-2, выполняющей протективную роль. Показано, что дефицит ММП-2 вызывает активацию ЗКП и ускоряет фиброз в мышиных моделях фиброза, индуцированного CCl4 и холестазом [39, 40], предположительно, за счет активации продукции ТИМП-1 [40]. Кроме того, показано, что ММП-2 подавляет экспрессию коллагена α1(I) активированными ЗКП, обеспечивая тем самым защитную роль при фиброгенезе [39]. Согласно данным Were et al. [81], уровень мРНК гена NLRP3 в печени повышен при НАСГ и коррелирует с отложением коллагена, при этом делеция Nlrp3 у мышей с индуцируемым НАСГ и фиброзом приводит к защите от фиброза печени и снижению мРНК гена коллагена I типа COL1A1 по сравнению с мышами дикого типа. Таким образом, можно предположить, что активация воспаления при СП приводит к активации экспрессии гена NLRP3, что влечет за собой повышение экспрессии гена, кодирующего про-альфа 1-цепь коллагена I. Уровень ММП-2, способной подавлять экспрессию коллагена α1(I) активированными ЗКП, при этом снижен, что приводит к избыточному синтезу коллагена I, важного компонента ВКМ печени.

Нами впервые показано, что повышение концентрации ММП-9 в плазме крови пациентов с НАСГ-СА имеет диагностическую значимость для выявления НАСГ-СА среди пациентов с простым стеатозом с оптимальным порогом отсечения >389,50 пг/мл ММП-9 в плазме крови (табл. 3). Эти результаты имеют потенциальную клиническую ценность для диагностики ранних форм НАЖБП при отсутствии значимого фиброза. Другими исследователями предпринимались попытки оценить уровень ММП в крови пациентов НАЖБП и рассмотреть возможность использования данных показателей в качестве маркеров разграничения форм заболевания (НАСГ и СП) и стадий фиброза. Trojanek et al. [71] показали, что у детей с НАЖБП уровни мРНК MMP9 и TIMP2 в ЛПК и концентрация ММП-9 и ТИМП-1 в плазме повышены по сравнению с контрольной группой. Однако группа пациентов в данном исследовании была сформирована только из детей с высоким уровнем АЛТ и АСТ [71]. В другой работе сывороточные уровни ММП-9, ТИМП-1 и ТИМП-2 были оценены в качестве клинико-лабораторных маркеров фиброза печени при НАЖБП [73]. Согласно расчетам по формуле Кульбака, авторы отнесли уровень ММП-9 в сыворотке крови к наиболее информативным показателям в оценке прогрессирования начальных стадий фиброза (I → II), а уровень ТИМП-1 и ТИМП-2 – к более информативным в отношении прогрессирования фиброза II в III стадию. При этом статистически значимые различия между группами пациентов в зависимости от степени фиброза выявлены только по уровню ТИМП-2 и не обнаружены для концентрации ММП-9 и ТИМП-1 в сыворотке крови [73]. Другими авторами был выявлен повышенный уровень ММП-2 и ММП-9 в крови у больных НАЖБП по сравнению с контролем, однако данные показатели не имели диагностической значимости для различения НАСГ от СП. При этом около половины пациентов с НАЖБП имели сахарный диабет [100]. В одном исследовании было показано, что уровень ММП-9 имеет прогностическую значимость для выявления НАСГ у пациентов с морбидным ожирением, которым показана бариатрическая операция [101]. В проведенное нами исследование не были включены пациенты НАЖБП с диабетом, морбидным ожирением, выраженным фиброзом. Кроме того, мы рассматривали НАСГ разной степени гистологической активности, в том числе НАСГ-СА.

Мы считаем, что выявленное нами повышение уровня ММП-9 в крови при раннем НАСГ (НАСГ-СА) связано с ролью ММП-9 в активной миграции иммунокомпетентных клеток крови в печень на раннем этапе трансформации стеатоза печени в стеатогепатит, когда запускаются гепатоцеллюлярная баллонная дегенерация, дольковое и портальное воспаление. Считается, что уровень экспрессии ММП-2 относительно постоянен и не зависит от содержания цитокинов или факторов роста, а базальные уровни ММП-9 обычно низки, и ее экспрессия может индуцироваться повышенным уровнем цитокинов/хемокинов, включая ФНОα [56]. Нами показано, что концентрации основных провоспалительных цитокинов (ФНОα, ИЛ-6, ИЛ-8) в крови при СП и НАСГ выше по сравнению с контролем и не различаются в зависимости от формы НАЖБП и активности НАСГ (табл. 5). Цитокины и другие провоспалительные факторы могут индуцировать выработку ММП-9 моноцитами, лейкоцитами, макрофагами и фибробластами [29, 56]. ММП-9, в свою очередь, участвует в процессах воспаления, активируя провоспалительные цитокины, такие как ФНОα и ИЛ-1β [51, 70], а также способствуя инфильтрации лейкоцитов в печень [48–50]. Накоплены данные, свидетельствующие о снижении инфильтрации лейкоцитов в печень при дефиците ММП-9. В модели экспериментально вызванного стеатоза у мышей нокаут гена Mmp9 приводил к снижению инфильтрации лейкоцитов, экспрессии провоспалительных цитокинов и некроза печени по сравнению с мышами дикого типа [48]. Также показано, что ММП-9 является критическим медиатором миграции лейкоцитов при повреждении печени, вызванном ишемией/реперфузией [49]. ММП-9 способствует адгезии лейкоцитов к эндотелиальным клеткам и транспорту нейтрофилов в воспаленные ткани посредством расщепления большого эндотелина-1 (ET-1) с образованием ET-1(1–32), который связывается с рецептором эндотелина А, приводя к снижению экспрессии L-селектина и активации интегрина CD11b/CD18 на поверхности нейтрофилов [50]. Таким образом, высокий уровень ММП-9 в плазме крови при раннем НАСГ (НАСГ-СА) может быть связан с активацией воспалительного процесса при прогрессировании НАЖБП от СП к НАСГ, в том числе с активной миграцией иммунокомпетентных клеток крови в печень.

Что касается уровня ММП-9 при более высокой активности НАСГ (НАСГ-УА, -ВА), он оказался понижен до уровня контроля, что может быть связано с преобладанием антифибротических эффектов данной металлопротеазы. Участие ММП-9 в антифибротических механизмах при НАСГ косвенно подтверждается результатами корреляционного анализа, согласно которым ММП-9 заметно отрицательно коррелирует с АЛТ и APRI при НАСГ-СА и также отрицательно – с ИГА при НАСГ-УА (табл. 6). Отрицательная корреляция уровня ММП-9 в крови с показателями фиброза была также выявлена в работе Goyale et al. [102]. Есть подтверждения того, что ММП-9 играет важную роль в разрешении фиброза печени [42, 43]. ММП-9 может активировать апоптоз ЗКП [41], а также способствовать переключению макрофагов с М1 (воспалительного) на М2 (прорегенеративный) тип [42].

Ранее нами были показаны различия цитокинового профиля и уровней некоторых показателей апоптоза в крови пациентов с разными формами НАЖБП, что подтверждает тесную связь процессов воспаления и апоптоза при прогрессировании НАЖБП [77, 78]. Развитие НАСГ сопровождается активацией процессов воспаления, фиброза и апоптоза [19, 20]. Согласно результатам анализа связи между изменениями концентрации ММП-9 и уровнем изучаемых показателей крови пациентов НАЖБП и здоровых людей, при НАСГ-СА уровень ММП-9 в плазме отрицательно коррелирует с уровнем мРНК гена ADAM17 в ЛПК и положительно – с содержанием рИЛ-6Р в крови (табл. 6). Уровень транскриптов гена ADAM17 в ЛПК при НАСГ высокой активности выше, чем у здоровых людей и пациентов групп НАСГ-СА и -УА. ADAM17 является важным регулятором процессов воспаления и регенерации, расщепляя эктодомены различных трансмембранных белков, таких как факторы роста, рецепторы и их лиганды, цитокины и молекулы клеточной адгезии [103], а также принимает участие в процессах апоптоза и фиброза [80]. Фермент ADAM17 опосредует индуцированный апоптозом каспазозависимый шеддинг растворимого рецептора ИЛ-6 (рИЛ-6Р) из клеточной мембраны, осуществляет протеолитическое высвобождение ФНОα [80]. Ранее нами выявлена тесная связь изменения уровня рИЛ-6Р с процессами апоптоза ЛПК и гепатоцитов [78]. Li et al. [79] показали, что ADAM17 опосредует экспрессию ММП-9 через ось ADAM17/TNFα/NF-κB. Также авторы показали, что нацеливание на ADAM17 интерферирующей РНК с помощью лентивирусного вектора подавляет индуцированную липополисахаридом экспрессию ММП-9 в эпителиальных клетках легких посредством ингибирования передачи сигналов TNFα/NF-κB [79]. Вероятно, одной из ключевых молекул в реализации выявленной нами сильной положительной связи плазменных уровней ММП-9 и рИЛ-6Р при НАСГ-ВА (табл. 6) выступает ADAM17. Логично было бы ожидать, что высокая концентрации рИЛ-6Р в крови будет соответствовать высокому уровню мРНК гена ADAM17, но, по нашим данным, при НАСГ-ВА уровень мРНК гена ADAM17 в ЛПК оказался выше, чем у здоровых людей, НАСГ-СА и -УА (табл. 4), а уровень рИЛ-6Р – ниже, чем у других групп (табл. 5). Здесь необходимо отметить, что мы оценивали экспрессию ADAM17 только на уровне транскриптов гена, поэтому не исключено, что на уровне белка могут быть получены иные данные.

В последнее время появляется все больше сведений об участии ММП в реализации апоптоза гепатоцитов. Показано, что у Mmp9–/–-мышей ослаблена регенерация печени после частичной гепатэктомии, снижен уровень апоптоза гепатоцитов (согласно результатам TUNEL) и экспрессия активной формы каспазы 3 [67]. В работе An et al. [104] был описан эффект розмариновой кислоты на клетки HepG2. Обработка розмариновой кислотой дозозависимо усиливала апоптоз клеток HepG2, при этом экспрессия ММП-9 снижалась, а уровень расщепленной каспазы 3 был увеличен [104]. В нашем исследовании уровень ФЦК-18, который является специфическим показателем апоптоза гепатоцитов, повышен при СП и НАСГ относительно контроля и нарастает при прогрессировании НАСГ (табл. 1). При этом активность каспазы 3 в периферических лейкоцитах при НАСГ-УА и -ВА выше, чем у здоровых людей (табл. 5). Нами выявлена заметная положительная корреляция между уровнем ММП-9 в плазме и активностью каспазы 3 в ЛПК доноров контрольной группы, в то время как при НАСГ-УА и -ВА данные показатели коррелируют отрицательно (табл. 6). Таким образом, при НАЖБП уровень ММП-9 может быть связан не только с воспалением, но и с процессом апоптоза. Вероятно, на фоне активации воспаления при переходе СП к раннему НАСГ повышается уровень ММП-9 в крови. При повышении активности НАСГ происходит усиление апоптоза гепатоцитов (согласно уровню ФЦК-18), повышается уровень активности каспазы 3 в ЛПК, при этом уровень ММП-9 в крови снижается до уровня контроля и СП. Полученные нами данные о снижении уровня ММП-9 при усилении апоптоза согласуются с результатами культурального эксперимента An et al. [104].

Таким образом, уровень ММП-2 и ММП-9 может быть связан с наличием и активностью воспаления в паренхиме печени, в том числе на ранних стадиях патогенеза НАЖБП, когда имеет место низкоуровневое воспаление и запуск процессов фиброгенеза. Снижение уровня ММП-2 в крови при СП может означать подавление противовоспалительных и антифибротических реакций, в которых участвует ММП-2. С другой стороны, при СП активируются провоспалительные процессы, в том числе экспрессия гена NLRP3 в периферических лейкоцитах больных НАЖБП, что было показано нами впервые. Развитие НАСГ сопровождается активацией процессов воспаления, фиброза и апоптоза. Высокий уровень ММП-9 в плазме крови при раннем НАСГ (НАСГ-СА) может быть связан с активацией воспалительного процесса при прогрессировании НАЖБП от СП к НАСГ. Провоспалительные факторы индуцируют продукцию ММП-9, которая усиливает воспаление, процессируя провоспалительные цитокины и способствуя инфильтрации лейкоцитов в печень. Дальнейшее снижение уровня ММП-9 при прогрессировании НАСГ может быть связано с преобладанием антифибротических эффектов данной металлопротеазы, а также с активацией процессов апоптоза. Возможно, определенную роль в реализации этой связи играет ADAM17.

Ограничения исследования. Роль тканевых ингибиторов металлопротеиназ в регуляции экспрессии ММП-2 и -9 при прогрессировании НАЖБП еще предстоит оценить. Кроме того, ограничением данного исследования может служить отсутствие данных об уровне протеолитической активности ММП-2 и ММП-9 в крови исследуемых, что затрудняет сравнение результатов с уже имеющимися в литературе сведениями [105, 106].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами впервые показано одновременное снижение ММП-2 при СП на фоне активации NLRP3-зависимых провоспалительных каскадов, что может иметь значение при дифференциальной диагностике простого стеатоза, если в будущих исследованиях будет подтверждено, что уровень ММП-2 стабильно снижен на протяжении всей стадии стеатоза. Мы также обнаружили повышение ММП-9 при НАСГ-СА, отражающее дебют морфологической трансформации заболевания, миграцию лейкоцитов и гибель гепатоцитов. В связи с этим считаем, что ММП-9-связанные молекулярно-биологические каскады могут открыть новые терапевтические мишени, которые помогут купировать трансформацию стеатоза в стеатогепатит. Мы впервые показали, что уровень ММП-9 в плазме крови >389,50 пг/мл имеет диагностическую значимость для выявления раннего НАСГ (слабой активности) среди пациентов с простым стеатозом, что представляется особенно перспективным для диагностики НАСГ из-за невозможности выполнения биопсии печени по этическим причинам и вследствие диагностических ограничений.

Полученные результаты расширяют имеющееся на данный момент понимание роли ММП-2 и ММП-9 в реализации процессов воспаления, фиброза и апоптоза при прогрессировании НАЖБП. Представляется перспективным более глубокое изучение роли желатиназ на ранних стадиях заболевания, в том числе при трансформации стеатоза печени в НАСГ, с целью разработки терапевтических стратегий для снижения риска прогрессирования заболевания.

Вклад авторов. И.В. Курбатова – концепция, планирование и проведение экспериментов, статистическая обработка и обсуждение результатов, написание и редактирование текста; Л.В. Топчиева – планирование и проведение экспериментов, обсуждение результатов, редактирование текста; О.П. Дуданова – формирование групп исследования, обсуждение результатов, редактирование текста; А.А. Шиповская – формирование и клинико-лабораторная характеристика групп исследования.

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания по теме № FMEN-2022-0009 (государственная регистрация № 122031100064-4).

Благодарности. Исследования выполнены на научном оборудовании Центра коллективного пользования ФИЦ «Карельский научный центр РАН».

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием людей, соответствуют этическим стандартам национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Sobre autores

I. Kurbatova

Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Autor responsável pela correspondência
Email: irina7m@yandex.ru
Rússia, 185910, Petrozavodsk, Karelia

L. Topchieva

Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Email: irina7m@yandex.ru
Rússia, 185910, Petrozavodsk, Karelia

O. Dudanova

Petrozavodsk State University

Email: irina7m@yandex.ru
Rússia, 185910, Petrozavodsk, Karelia

A. Shipovskaya

Petrozavodsk State University

Email: irina7m@yandex.ru
Rússia, 185910, Petrozavodsk, Karelia

Bibliografia

Arquivos suplementares