Post-Integrational DNA Repair of HIV-1 Is Associated with the Activation of DNA-PK and ATM Cellular Protein Kinases and Phosphorylation of Their Targets

Толық мәтін

Принятые сокращения: кДНК – ДНК копия генома ВИЧ-1; ПИР – постинтеграционная репарация; ATM – мутантный при атаксии-телеангиэктазии белок; ATR – атаксия-телеангиэктазия и Rad3-родственный белок; Chk1 и Chk2 – киназы 1 и 2 контрольной точки; DNA-PK – ДНК-зависимая протеинкиназа, DNA-PKcs – каталитическая субъединица DNA-PK; HR – гомологичная рекомбинация; NHEJ – процесс негомологичного соединения концов.

ВВЕДЕНИЕ

Жизненный цикл вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) – сложный многостадийный процесс, направленный на встраивание вирусного генетического материала в геном клетки и продукцию новых вирионов. На первых этапах после проникновения вируса в клетку его РНК-геном переводится в форму двуцепочечной ДНК (кДНК) под действием вирусного фермента – обратной транскриптазы. Эта кДНК в комплексе с другим важным вирусным ферментом – интегразой – транспортируется в ядро, где интеграза катализирует встраивание кДНК в геном клетки. Этот процесс, называемый интеграцией, приводит к появлению повреждений клеточной ДНК в местах встраивания вирусной кДНК: пятинуклеотидных одноцепочечных участков, расположенных по краям от встроенной кДНК, а также неспаренных динуклеотидов CA на 5′-концах кДНК [1–3].

Эти повреждения должны быть исправлены для того, чтобы завершить интеграцию, восстановить целостность генома и обеспечить репликацию вируса [4]. Процесс исправления повреждений и восстановления целостности генома получил название постинтеграционной репарации (ПИР). Известно, что основную роль в ПИР играют клеточные белки [4–6], однако точный механизм этого процесса не удалось установить до сих пор, как и не удалось прийти к консенсусу в вопросе, какие именно клеточные белки обеспечивают восстановление целостности поврежденной ДНК.

В начале 2000-х годов стали появляться указания на возможное участие протеинкиназ из семейства PIKK – ключевых регуляторов репарации двуцепочечных разрывов в ДНК – в репликации ВИЧ-1. К таким участникам относятся ДНК-зависимая протеинкиназа (DNA-PK), сформированная белками Ku70, Ku80 и каталитической субъединицей DNA-PK (DNA-PKcs), и мутантный при атаксии-телеангиэктазии белок ATM (аtaxia telangiectasia mutated protein) [7–10]. Однако вопрос о том, в каком именно этапе жизненного цикла вируса эти белки принимают участие, оставался открытым. В частности, вызывала сомнения возможность участия этих белков в процессе ПИР, поскольку в результате интеграции возникают одноцепочечные бреши в ДНК, но не образование двуцепочечных разрывов. Тем не менее нам удалось показать, что клеточные белки Ku70, Ku80, DNA-PKcs и ATM участвуют в процессе ПИР, причем к местам повреждений ДНК, вызванных интеграцией, эти белки привлекаются за счет образования комплекса между интегразой ВИЧ-1 и белком Ku70, входящим в состав DNA-PK [11, 12]. Ингибиторы фосфорилирующей активности как DNA-PK, так и ATM подавляли вирусную репликацию, действуя именно на этапе постинтеграционной репарации ВИЧ-1 [11, 12]. Это позволило сделать вывод, что обе протеинкиназы, DNA-PK и АТМ, активируются в результате взаимодействия с интегразой и запускают тем самым процессы репарации ДНК и регуляции клеточного цикла. Однако до сих пор не известно, какие именно мишени этих киназ фосфорилируются в ходе ПИР и насколько этот процесс в целом напоминает репарацию двуцепочечных разрывов ДНК.

В настоящем исследовании мы оценили, фосфорилируются ли стандартные мишени клеточного ответа на двуцепочечные разрывы ДНК, инициируемого протеинкиназами ATM и DNA-PK, в ходе ПИР ВИЧ-1. Параллельно было проанализировано, происходит ли фосфорилирование третьей протеинкиназы из семейства PIKK – ATR (атаксия-телеангиэктазия и Rad3-родственный белок; ataxia-telangiectasia and Rad3-related protein) и ее основной мишени, Chk1. Эта киназа инициирует репарацию одноцепочечных разрывов в ДНК, например, при остановке репликативной вилки, но не участвует в процессе ПИР. Таким образом, мы оценили накопление фосфорилированных форм самих протеинкиназ: pSer2056-DNA-PKcs, pSer1981-ATM и pSer428-ATR, а также их наиболее распространенных мишеней: pSer345-Chk1, pThr68-Chk2, pSer139-H2AX и pSer15-p53, в ответ на трансдукцию клеток лентивирусным вектором на основе генома ВИЧ-1. Установлено, что протеинкиназа ATR, как и ее мишень, киназа 1 контрольной точки (Chk1), практически не модифицируются в ходе ПИР, в то время как ATM и DNA-PKcs подвергаются автофосфорилированию. Фосфорилируются также по указанным выше сайтам все протестированные мишени ATM и DNA-PK: Chk2, H2AX и p53. Важно, что фосфорилирование ATM, DNA-PKcs, киназы 2 контрольной точки (Chk2) и гистона H2AX происходит только в случае успешной интеграции и последующего образования комплекса интегразы с Ku70, а фосфорилирование p53 не связано с интеграцией и происходит в ответ на накопление линейной формы кДНК ВИЧ-1. Нам также удалось впервые показать, что фосфорилированный гистон H2AX образует в ядрах трансдуцированных клеток локусы, типичные для процесса репарации двуцепочечных разрывов в ДНК, причем их количество и средняя интенсивность флуоресценции локусов напрямую отражают эффективность протекания ПИР и могут использоваться в качестве маркера эффективности этого процесса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование клеток и наработка VSV-G псевдотипированных репликативно-некомпетентных векторов на основе генома ВИЧ-1. Клетки HEK293T культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в атмосфере 5% СО₂ при 37 °C. Для наработки VSV-G псевдотипированных репликативно-некомпетентных лентивирусных векторов на основе генома ВИЧ-1 c природным вариантом интегразы (HIV_wt) клетки HEK293T котрансфицировали кальций-фосфатным методом плазмидами pCMV-VSV-G («Addgene», США; #8454), pCMVΔR8.2 («Addgene»; #12263) и LeGo-G/BSD («Addgene»; #27354) в соотношении 1/2/3 по массе. Для сборки векторов с мутантными формами интегразы HIV_mut, HIV_E152A, HIV_F185A плазмида pCMVΔR8.2 была заменена на аналогичную плазмиду с указанной мутацией, полученную в нашей лаборатории. Через 6 ч после трансфекции среду заменяли на новую. Лентивирусные векторы собирали через 48 и 72 ч после трансфекции. Векторы концентрировали ультрацентрифугированием с использованием углового ротора Type 45 Ti («Beckman», США) в течение 2 ч при 30 000 g и температуре 4 °C.

Определение титра лентивирусных векторов. Для определения титра вектора HIV_wt в лунки 24-луночного планшета («Corning», США) переносили по 100 000 клеток HEK293T. Через 24 ч готовили серию 10-кратных разведений исходного образца вектора, и 5 мкл исходного вектора или его разведений использовали для трансдукции клеток HEK293T. Через 48 ч с момента трансдукции оценивали процентное содержание GFP-положительных клеток, содержащих зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein), в популяции с помощью метода проточной цитометрии на приборе CytoFlex («Beckman»), и на основании этих данных рассчитывали концентрацию трансдуцирующих единиц в образцах. Поскольку векторы HIV_mut, HIV_E152A и HIV_F185A в своем составе содержат мутантные формы интегразы и у них нарушен один из этапов раннего цикла ВИЧ-1, титр псевдовирусных частиц в этом случае оценить с использованием проточной цитометрии было невозможно. В этом случае титр определяли с помощью ИФА-теста к p24-антигену ВИЧ-1 («Вектор-Бест», Россия).

Вестер-блот-анализ. 1 млн клеток HEK293T трансдуцировали лентивирусным вектором HIV_wt при множественности инфекции (MOI), равной 10, или эквивалентным количеством лентивирусных векторов HIV_mut, HIV_E152A или HIV_F185A. Через 2 ч среду с несвязавшимся вектором отбирали, клетки промывали 2 раза 1× ФСБ (фосфатно-солевой буфер, pH = 7,4), после чего помещали в среду для культивирования. Через 10 ч после трансдукции клетки лизировали при 4 °С RIPA-буфером («Servicebio», Китай) с добавлением ингибиторов фосфатаз Phosphatase inhibitor cocktail 2 и 3 («Sigma», США), а также ингибиторов протеаз Halt protease inhibitor cocktail («Pierce», США). Перед анализом остатки клеток удаляли центрифугированием при 14 000 g в течение 10 мин при 4 °С. Для каждой экспериментальной точки определяли содержание белка в образцах с помощью набора DC protein assay kit («Bio-Rad», США), на гель наносили одинаковое количество белка. Анализируемые образцы клеточных лизатов разделяли в градиентном (4–15%) геле Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gels («Bio-Rad»), переносили на PVDF-мембрану («Bio-Rad») методом полусухого переноса на приборе Trans-Blot Turbo Transfer System («Bio-Rad»). Исследуемые белки визуализировали первичными мышиными антителами на фосфорилированные формы р53 (pSer15), первичными кроличьими антителами на DNA-PK (pSer2056), ATM (pSer1981), ATR (pSer428), Chk1 (pThr68), Chk2 (pSer345), γH2AX (pSer139) («Cell Signaling Technology», США). В качестве вторичных антител использовали HRP-конъюгированные антитела против кроличьих или мышиных антител («Cell Signaling Technology»). Визуализацию целевых белковых полос проводили с помощью субстрата пероксидазы хрена Clarity Western ECL substrate («Bio-Rad») в системе детекции люминесценции ChemiDoc MP system («Bio-Rad»).

Для оценки влияния активности DNA-PK и ATM на накопление фосфорилированных форм p53 (pSer15) и H2AX (pSer139) при трансдукции клеток лентивирусным вектором использовали ингибиторы DNA-PK – Nu7441 («Sigma») и ATM – Ku-55933 («Sigma») в концентрациях, при которых наблюдается 50%-ное подавление ПИР [12]. Ингибиторы были растворены в диметилсульфоксиде. В работе с ингибиторами во всех экспериментальных точках поддерживали уровень диметилсульфоксида в среде на уровне 0,5%.

Оценка образования локусов γH2AX. Клетки HEK293T рассевали на предварительно обработанные фибронектином покровные стекла, через 24 ч клетки трансдуцировали лентивирусными векторами HIV_wt, HIV_mut, HIV_E152A, HIV_F185A при MOI = 15. Через 12 ч после трансдукции клетки фиксировали 4%-ным параформальдегидом (ПФА) на 1× ФСБ в течение 15 мин при комнатной температуре. Параллельно с указанными образцами был подготовлен препарат нетрансдуцированных клеток для оценки эндогенного уровня локусов (отрицательный контроль), а также клетки, обработанные в течение 1 ч перед фиксацией 50 мкМ этопозидом (положительный контроль). Окрашивание препаратов проводили по протоколу набора реагентов HCS DNA Damage Kit («Invitrogen», США). На последнем этапе образцы заключали в среду (Mowiol, DAPI 1 мкг/мл, DABCO 1 мг/мл, «Sigma»). Детектировали флуоресценцию Alexa Fluor 555 и DAPI на микроскопе Eclipse-Ti2 («Nikon», Япония) с объективом 60×/1.4 и sCMOS-камерой Neo («Andor», Ирландия) (эффективный размер пикселя – 110 нм). Подсчет количества локусов и интенсивностей локусов проводили в программе ImageJ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

DNA-PKcs, ATM и их мишени Chk2, H2AX и p53 фосфорилируются в ответ на трансдукцию клеток векторами на основе генома ВИЧ-1. Ранее при изучении вопроса возможного участия представителей семейства PIKK-киназ в ранних этапах репликации ВИЧ-1, а именно в регуляции ПИР, мы показали, что протекание ПИР зависит от фосфорилирующей активности ATM и DNA-PK, но не ATR [12]. Поскольку эти две киназы обычно активируются при появлении двуцепочечных разрывов ДНК [13], а в продукте интеграции кДНК ВИЧ-1 такие разрывы отсутствуют, можно было предположить, что дальнейший спектр клеточных реакций может отличаться от реакций, характерных для репарации двуцепочечных разрывов. В связи с этим необходимо было проверить, фосфорилируются ли хорошо известные мишени ATM и DNA-PK при обработке клеток лентивирусными векторами на основе генома ВИЧ-1.

В качестве таких мишеней далее мы рассматривали сами ферменты DNA-PKcs и ATM, т.к. они автофосфорилируются в ходе активации, а также их нижестоящие мишени Chk2, p53 и репаративный гистон H2AX. Помимо них, мы дополнительно решили проанализировать статус фосфорилирования ATR (автофосфорилируется при активации) и его мишени Chk1 в качестве негативного контроля, поскольку киназа ATR не участвует в репликации ВИЧ-1, и, следовательно, она не должна активироваться в ходе ПИР. Клетки HEK293T трансдуцировали VSV-G псевдотипированным репликативно-некомпетентным лентивирусным вектором на основе генома ВИЧ-1 с природным вариантом интегразы (HIV_wt), и через 12 ч в белковых лизатах оценивали статус фосфорилирования Ser2056 в составе DNA-PKcs, Ser1981 – в составе ATM, Thr68 – в Chk2, Ser139 – в H2AX и Ser15 – в p53, а также Ser428 – в ATR и Ser345 – в Chk1. В качестве контрольного образца использовались нетрансдуцированные клетки (рис. 1). Анализ фосфорилированных форм проводили через 12 ч после трансдукции, поскольку максимальная эффективность ПИР наблюдается в интервале 10–18 ч после трансдукции [12].

 

Рис. 1. Анализ уровня фосфорилирования белков DNA-PKcs, ATM, ATR, Chk1, Chk2, p53 и H2AX в клетках, трансдуцированных HIV_wt, HIV_mut или нетрансдуцированном контроле (Cntr), через 12 ч после добавления лентивирусных векторов. На графике представлены уровни фосфорилированной формы белка в клетках, трансдуцированных HIV_wt или HIV_mut, относительно нетрансдуцированного образца (среднее ± SD по трем независимым повторам). Статистическая значимость изменений в уровне фосфорилированного белка оценивалась с помощью двухфакторной ANOVA c поправкой на множественные сравнения по Тьюки; ns – статистические отличия отсутствуют, **** p-value < 0,0001

 

В образцах, обработанных вектором HIV_wt, детектировались фосфорилированные формы белков pSer2056-DNA-PKcs, pSer1981-ATM, pThr68-Chk2, pSer139-H2AX (γH2AX), а также pSer15-p53, причем их количества существенно превышали фоновые значения в контрольных образцах (рис. 1). В этих условиях, как и ожидалось, ни ATR, ни его мишень Chk1 практически не фосфорилировались.

Изменение статуса фосфорилирования указанных белков может быть вызвано как протеканием ПИР, в ходе которого активируются DNA-PK и ATM, так и другими факторами, не связанными с ПИР. Для того чтобы понять, действительно ли модификации белков вызваны ПИР, мы дополнительно оценили поведение этих мишеней при обработке клеток лентивирусным вектором HIV_mut, кодирующим интегразу, с аминокислотными заменами E212A/L213A, препятствующими ее взаимодействию с Ku70 [14]. Такие мутации в составе интегразы нарушают эффективное протекание ПИР у ВИЧ-1 [11]. В этом случае практически все мишени, за исключением p53, фосфорилировались слабее (рис. 1).

Накопление γH2AX и pSer15-p53 происходит по двум независимым путям. Для выяснения причин различий фосфорилирования H2AX и p53 при трансдукции клеток векторами на основе ВИЧ-1 нами дополнительно был получен вектор HIV_E152A, содержащий в своем составе каталитически неактивную форму интегразы (замена E152A) и не способный интегрировать вирусную кДНК [15], а также вектор HIV_F185A, содержащий интегразу с заменой F185A. Эта аминокислотная замена в составе интегразы препятствует ее связыванию с обратной транскриптазой ВИЧ-1, что нарушает корректное протекание обратной транскрипции [16]. В результате при трансдукции клеток вектором HIV_E152A в них накапливается линейная двуцепочечная кДНК, но она не может встроиться в геном клетки-хозяина, а в случае вектора HIV_F185A не происходит даже обратная транскрипция и в клетках присутствует лишь РНК-геном вируса.

Клетки HEK293T трансдуцировали векторами HIV_wt, HIV_mut, HIV_E152A или HIV_F185A, и через 12 ч в лизатах оценивали количество γH2AX и pSer15-p53 методом Вестерн-блоттинга (рис. 2). Гистон H2AX эффективно фосфорилировался только в случае HIV_wt, а фосфорилирование p53 происходило во всех случаях, когда в клетке синтезировалась кДНК, т.е. при трансдукции клеток векторами HIV_wt, HIV_mut и HIV_E152A. Следовательно, фосфорилирование р53 не зависело ни от образования комплекса интегразы с Ku70, ни от способности интегразы встраивать вирусную кДНК в геном клетки, однако оно не наблюдалось при трансдукции клеток вектором HIV_F185, не способным к обратной транскрипции. На основании этих данных можно предположить, что сигналом для фосфорилирования Ser15 в составе p53 является сам факт появления линейной двуцепочечной ДНК в трансдуцированных клетках.

 

Рис. 2. Вестерн-блот-анализ фосфорилированных форм p53 (pSer15) и H2AX (pSer139). Cntr – нетрансдуцированные вектором клетки; HIV_wt, HIV_mut, HIV_E152A, HIV_F185A – клетки, трансдуцированные векторами на основе ВИЧ-1 с природным вариантом интегразы или соответствующей мутантной формой; образцы HIV_wt + Nu7441 и HIV_wt + Ku-55933 после трансдукции клеток вектором HIV_wt дополнительно обрабатывали ингибитором DNA-PKcs – Nu7441 (2 мкМ), или ингибитором ATM – Ku-55933 (5 мкМ)

 

Мы также оценили кинетику накопления γH2AX и pSer15-p53 при трансдукции клеток векторами HIV_wt, HIV_mut и HIV_E152A в интервале времени 10–18,5 ч после трансдукции, когда наблюдается максимальная эффективность ПИР [12]. В случае псевдовируса HIV_wt высокий уровень фосфорилирования H2AX наблюдался уже через 10 ч после трансдукции и сохранялся на протяжении всего этапа ПИР вплоть до 18,5 ч (рис. 3). При трансдукции клеток вектором HIV_mut также накапливается γH2AX, но профиль его накопления существенно отличался: через 10 ч уровень γH2AX незначительно превышал фоновые значения, после чего постепенно нарастал, достигая максимума к 18,5 ч. Аналогичный профиль накопления γH2AX был зафиксирован для вектора HIV_E152 (рис. 3). Очевидно, фосфорилирование H2AX в случае HIV_mut и HIV_E152A обусловлено накоплением в ядрах трансдуцированных клеток линейной кДНК вектора, а не повреждениями ДНК, возникающими в ходе интеграции, как в случае HIV_wt. Профили накопления pSer15-p53 идентичны для всех трех типов векторов: через 10 ч после трансдукции фосфорилированная форма белка незначительно превосходит контрольные уровни, постепенно возрастает, достигая максимального уровня через 18,5 ч (рис. 3).

 

Рис. 3. Кинетика накопления γH2AX и pSer15-p53 в клетках HEK293T, трансдуцированных векторами HIV_wt, HIV_mut или HIV_E152A через 10, 12, 14 и 18,5 ч после трансдукции. а – Вестерн-блот-анализ; б – количественный анализ результатов вестерн-блоттинга. За 1 принят уровень γH2AX и pSer15-p53 в клетках, трансдуцированных HIV_wt через 18,5 ч после добавления вектора. Образец, обозначенный как Cntr, не трансдуцирован вектором

 

Вышеописанные результаты демонстрируют, что фосфорилирование p53 по Ser15 происходит не на этапе ПИР, однако остается открытым вопрос, участвуют ли в этой модификации киназы ATM и DNA-PK. Для ответа на него мы оценили накопление фосфорилированной формы p53 при трансдукции клеток HEK293T вектором HIV_wt в присутствии ингибитора DNA-PKcs (Nu7441) или ингибитора ATM (Ku-55933). Оба ингибитора одинаково эффективно подавляли накопление γH2AX (рис. 2). Фосфорилирование p53 эффективно подавлялось ингибитором DNA-PKcs, а ингибитор ATM значительно в меньшей степени влиял на этот процесс (рис. 2).

Таким образом, в ответ на интеграцию вирусной кДНК и ПИР специфично фосфорилируются только H2AX. Фосфорилирование p53 происходит в ответ на накопление в трансдуцированных клетках линейной кДНК ВИЧ-1, хотя и зависит от активности DNA-PKcs.

Накопление локусов γH2AX в ядрах трансдуцированных клеток может служить маркером успешности протекания ПИР. Обработка клеток ионизирующим излучением или агентами, вызывающими появление в клеточной ДНК двуцепочечных разрывов, приводит к появлению в ядрах клеток локусов γH2AX. Этот процесс преимущественно контролируется протеинкиназами ATM и DNA-PK [17]. Каждый локус содержит по крайней мере несколько сотен молекул γH2AX, и число локусов коррелирует с числом двуцепочечных разрывов по крайней мере на ранних стадиях репарации [18]. В нашем случае в ответ на ретровирусную интеграцию мы обнаружили увеличение уровня фосфорилирования гистона H2AX по Ser139, поэтому мы решили проверить, формируются ли локусы γH2AX в ядрах трансдуцированных клеток и зависит ли их формирование от способности интегразы взаимодействовать с Ku70.

Для этого клетки HEK293T трансдуцировали вектором HIV_wt при MOI = 10 или аналогичным по p24 количеством векторов HIV_mut, HIV_E152A и HIV_F185, и через 12 ч после трансдукции анализировали содержание локусов γH2AX методом иммуноцитохимии с использованием антител к pSer139-H2AХ и последующей визуализацией с помощью конфокальной микроскопии. Лишь в небольшой доле клеток без обработки лентивирусными векторами детектировались единичные локусы γH2AX (рис. 4, а). Для подтверждения работоспособности наших антител, использованных в работе, мы проанализировали накопление γH2AX в ядрах клеток, обработанных в течение 1 ч перед фиксацией этопозидом (50 мкМ) – известным ингибитором топоизомеразы II, который индуцирует накопление двуцепочечных разрывов в ДНК. В этих условиях практически все ядро клеток давало окрашивание антителами на γH2AX (рис. 4, б), что говорит о множественных повреждениях ДНК при такой концентрации этопозида.

 

Рис. 4. Накопление локусов γH2AX в клетках HEK293T, трансдуцированных векторами на основе генома ВИЧ-1. а–е – Конфокальные изображения локусов γH2AX в клетках HEK293T без обработки (а), обработанных 50 мкМ этопозидом в течение 1 ч перед фиксацией (б), трансдуцированных векторами HIV_wt (в), HIV_mut (г), HIV_E152A (д), HIV_F185A (е) при множественности инфекции (MOI), равной 10. Фиксация клеток проводилась через 12 ч после трансдукции. ж – Среднее число локусов γH2AX, приходящихся на одну клетку (проанализировано суммарно 5000 клеток в трех технических повторах для каждого типа воздействия); статистическая значимость отличий оценена с использованием дисперсионного анализа (ANOVA) с поправкой Тьюки на множественные сравнения; ns – отличия отсутствуют, *** p-значение < 0,001, **** p-значение < 0,0001; з – средняя интенсивность флуоресценции локусов γH2AX; статистическая значимость отличий оценена с помощью t-теста, ** p-значение < 0,01

 

При трансдукции клеток вектором HIV_wt через 12 ч после добавления псевдовируса в ядрах клеток мы зафиксировали образование четко различимых локусов гистона γH2AX разной интенсивности (рис. 4, в). В случае обработки клеток векторами HIV_E152A и HIV_F185A уровень γH2AX практически не отличался от контрольных клеток (рис. 4, д и е). При трансдукции клеток вектором HIV_mut, не способным эффективно инициировать ПИР, мы также наблюдали формирование локусов γH2AX (рис. 4, г), однако их среднее число на клетку и средняя интенсивность флуоресценции локусов была ниже, чем в случае HIV_wt в 1,4 и 2 раза соответственно (рис. 4, ж и з).

Таким образом, данные, полученные с помощью конфокальной микроскопии и вестерн-блоттинга о разнице в накоплении γН2АХ в клетках, трансдуцированных псевдовирусами с интегразой дикого типа и интегразой, не способной связываться с Ku70, позволяют сделать вывод, что γН2АХ может быть использован в качестве маркера эффективности протекания ретровирусной ПИР.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Протеинкиназы из семейства PIKK (PI3K-related kinases), ATM, DNA-PK и ATR, являются ключевыми регуляторами клеточного ответа на повреждения ДНК. ATM и DNA-PK активируются в ответ на двуцепочечные повреждения ДНК, а ATR – на протяженные однонитевые участки ДНК, связанные с RPA-белком (replication protein A). Распознавание этих повреждений и активация соответствующих киназ происходит при участии сенсоров указанных повреждений ДНК. Двуцепочечные разрывы ДНК распознаются гетеродимером Ku70–Ku80 или MRN-комплексом, что приводит к привлечению к местам повреждений DNA-PKcs или ATM соответственно. ATR к протяженным однонитевым участкам ДНК привлекается за счет кофактора – ATRIP [19]. Будучи активированными, эти белки фосфорилируют широкий спектр белков-мишеней, создавая оптимальные условия для репарации повреждений ДНК [19–22]. Две из этих киназ, ATM и DNA-PK, наряду с сигнальной функцией способны напрямую запускать процессы репарации двуцепочечных разрывов ДНК. Так, комплекс DNA-PK инициирует процесс негомологичного соединения концов (NHEJ, non-homologous end joining), а ATM – гомологичную рекомбинацию (HR, homologous recombination) [13]. Несмотря на такую строгую специализацию каждой из киназ, современные данные говорят в пользу того, что все три киназы могут взаимно влиять, дополняя или модулируя активности друг друга в зависимости от контекста, в котором находится повреждение ДНК [13, 17, 23–28].

При возникновении в клетке двуцепочечных разрывов ДНК и привлечении к ним DNA-PK-комплекса происходит автофосфорилирование каталитической субъединицы DNA-PKcs по аминокислотным остаткам, расположенным в кластерах PQR и ABCDE [29]. Наиболее изученной модификацией DNA-PKcs является фосфорилирование остатка S2056, расположенного в PQR-кластере. Данная модификация используется в качестве маркера активации DNA-PK [30], но, помимо этого, регулирует ее конформацию и активность [31, 32]. Если к сайту повреждения ДНК привлекается ATM-киназа, она, аналогично DNA-PK, подвергается автофосфорилированию по S1981, что приводит к ее димеризации и переходу в активную форму [33, 34]. Будучи активированными, DNA-PKcs и ATM способны регулировать активности друг друга путем модификации дополнительных сайтов [13, 28], а также фосфорилируют напрямую или посредством активации посредников ряд важных мишеней. Среди них особое внимание привлекают белки Chk2, p53 и репаративный гистон H2AX, накопление фосфорилированных форм которых (pThr68-Chk2, pSer15-p53 и pSer139-H2AX) происходит в ответ на генотоксический стресс [17, 35–38]. Если фосфорилирование Chk2 и p53 необходимо для остановки клеточного цикла и создания благоприятных условий для репарации ДНК через регуляцию экспрессии p53-зависимых генов [39], фосфорилирование гистона H2AX в местах повреждений ДНК регулирует репарацию ДНК напрямую, поскольку фосфорилированная форма гистона служит своеобразной платформой для привлечения к местам повреждений ДНК факторов репарации и удержания их в этом месте вплоть до момента удаления повреждения [40].

Аналогично ATM и DNA-PK, ATR автофосфорилируется по S428 в ходе ее активации в ответ на протяженные однонитевые фрагменты ДНК [41]. Активированная форма ATR фосфорилирует Chk1. При окислительном стрессе ATR также способна стимулировать фосфорилирование гистона H2AX и p53, но путем активации ATM [42].

Интеграция генома ВИЧ-1 в клеточную ДНК приводит к появлению повреждений ДНК. К таким повреждениям можно отнести пятинуклеотидные однонитевые участки по краям от места встраивания вирусной кДНК и неспаренные динуклеотиды 5′-AC-3′ на 5′-концах вирусной ДНК. Успешная репликация вируса напрямую зависит от репарации указанных повреждений ДНК [11]. Ранее мы показали, что ПИР зависит от способности интегразы ВИЧ-1 взаимодействовать с клеточным белком Ku70 – компонентом DNA-PK-комплекса, а также от активности двух киназ из PIKK-семейства – ATM и DNA-PK, но не ATR [11, 12]. Поскольку двуцепочечные разрывы ДНК отсутствуют в продукте интеграции ВИЧ-1, а активация ATM и DNA-PK зависит от образования комплекса интегразы с Ku70, мы задались вопросом, характерны ли для ПИР события фосфорилирования самих киназ и их мишеней, описанные ранее для репарации двуцепочечных разрывов в ДНК.

В данном исследовании мы проанализировали образование автофосфорилированных форм киназ pSer1981-ATM и pSer2056-DNA-PKcs, а также их мишеней pSer15-p53, pThr68-Chk2, pSer139-H2AX в ответ на трансдукцию клеток HEK293T лентивирусным вектором на основе генома ВИЧ-1. Дополнительно мы проанализировали, накапливается ли при трансдукции клеток фосфорилированная форма ATR (pSer428) и ее мишени Chk1 (pSer345). Мы обнаружили, что в ответ на ретровирусную трансдукцию в клетках накапливаются фосфорилированные формы ATM, DNA-PK, p53, Chk2 и H2AX, но не ATR и Chk1, что еще раз подтверждает отсутствие участия ATR в репликации ВИЧ-1 [12].

С помощью лентивирусного вектора HIV_mut, не способного инициировать процесс ПИР, было установлено, что автофосфорилирование киназ ATM и DNA-PK, а также фосфорилирование их мишеней Chk2 и H2AX зависит от образования комплекса интеграза–Ku70. В то же время фосфорилирование p53 по Ser15 не зависело от образования этого комплекса, поскольку его эффективность была одинаковой при трансдукции клеток векторами HIV_wt и HIV_mut. Анализ кинетики накопления pSer15-p53 при трансдукции клеток HIV_wt, HIV_mut и HIV_E152A, в котором подавлена интеграция, показал, что количество модифицированного p53 постепенно возрастает в интервале 10–18,5 ч, достигая максимума к 18,5 ч. Мы полагаем, что в нашей системе модификация p53 происходит не в результате ПИР, а просто за счет накопления в трансдуцированных клетках линейной неинтегрированной кДНК ВИЧ-1. Это предположение подтверждается отсутствием фосфорилирования р53 при использовании вектора HIV_F185, в котором не происходит обратной транскрипции.

В аналогичных условиях образование γH2AX эффективно происходило только в случае вектора, способного инициировать ПИР (HIV_wt), причем высокий уровень γH2AX наблюдался на протяжении всего периода ПИР (10–18,5 ч). При трансдукции клеток HIV_mut и HIV_E152A γH2AX также детектировался, но кинетика его накопления существенно отличалась от образцов, трансдуцированных HIV_wt. Возможно, накопление γH2AX в случае векторов, не способных к ПИР или интеграции, вызвано появлением в клетках линейной двуцепочечной кДНК аналогично тому, как это происходит при модификации p53. Нам также удалось показать, что γH2AX в трансдуцированных HIV_wt клетках распределен в ядре не диффузно, а формирует локусы, характерные для репарации двуцепочечных разрывов ДНК [18]. Отличия в кинетике накопления γH2AX при трансдукции клеток разными векторами на основе ВИЧ-1 позволили нам предположить, что образование γH2AX (их число и средняя интенсивность локусов) может служить индикатором успешности протекания ПИР ВИЧ-1.

Основываясь на полученных результатах, можно сделать вывод о том, что, хотя интеграция кДНК ВИЧ-1 не приводит к появлению двуцепочечных разрывов в клеточной ДНК, процесс репарации вызванных интеграцией повреждений генома клетки по крайней мере на начальной стадии очень похож на процессы репарации двуцепочечных разрывов ДНК. В ПИР участвуют те же PIKK-киназы, ATM и DNA-PK, что участвуют в процессах NHEJ и HR, они инициируют процесс ПИР путем автофосфорилирования и фосфорилирования своих мишеней – белков Chk2 и H2AX, как и в случае NHEJ и HR (рис. 5). Однако у этих процессов есть и серьезные отличия. Если к двуцепочечным разрывам в ДНК DNA-PKcs или ATM привлекаются за счет связывания, соответственно, гетеродимера Ku70–Ku80 или MRN-комплекса с ДНК, то в случае ПИР обе эти протеинкиназы привлекаются к местам повреждения ДНК в результате связывания белка Ku70 с вирусной интегразой (рис. 5). Кроме того, в ходе репарации двуцепочечных разрывов происходит фосфорилирование р53. На этапе же ПИР фосфорилирования p53 не происходит. Мы зафиксировали фосфорилированную форму р53 в ответ на накопление в трансдуцированных лентивирусными векторами клетках линейной кДНК ВИЧ-1, причем в образовании этой фосфорилированной формы р53 участвует не АТМ, а DNA-PK.

 

Рис. 5. Фосфорилирование белков из систем клеточного ответа на двуцепочечные разрывы ДНК при постинтеграционной репарации ВИЧ-1. Интеграза ВИЧ-1, расположенная в местах встраивания генома ВИЧ-1 и, соответственно, маркирующая повреждения ДНК, привлекает гетеродимерный комплекс Ku70–Ku80. Данный комплекс является строго необходимым для привлечения DNA-PK и ATM и последующей активации этих киназ в местах повреждений ДНК, вызванных интеграцией ВИЧ-1. DNA-PK и ATM автофосфорилируются по pSer2056 и pSer1981. Активированные в ходе ПИР киназы фосфорилируют мишени H2AX и Chk2, но не p53. ATR в ПИР не участвует и не активируется

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Постинтеграционная репарация ВИЧ-1 – важный этап в жизненном цикле вируса, без которого невозможна эффективная продукция новых вирусных частиц. Ранее нам удалось показать, что процесс ПИР запускается протеинкиназами из PIKK-семейства – ATM и DNA-PK, которые обычно участвуют в клетке в репарации двуцепочечных разрывов ДНК. Однако в ходе интеграции двуцепочечные разрывы не возникают, и к местам повреждений ДНК эти киназы привлекаются комплексом вирусной интегразы и клеточного белка Ku70 – компонентом DNA-PK.

В данном исследовании мы изучили, как меняется статус автофосфорилирования киназ из семейства PIKK (ATM, DNA-PK и ATR), а также их мишеней (Chk1, Chk2, H2AX и p53) в ходе ПИР ВИЧ-1. Было обнаружено, что ни протеинкиназа ATR, ни ее мишень Chk1 практически не модифицируются, в то время как ATM и DNA-PKcs подвергаются автофосфорилированию. Мишени двух последних киназ, а именно: Chk2, H2AX и p53, также фосфорилировались при трансдукции клеток лентивирусными векторами на основе генома ВИЧ-1. Однако если ATM, DNA-PK, Chk2 и H2AX подвергались модификации только в случае успешной интеграции и последующего образования комплекса интегразы ВИЧ-1 с Ku70, p53 модифицировался в ответ на накопление в трансдуцированных клетках кДНК и не зависел от способности интегразы взаимодействовать с Ku70. Основываясь на полученных результатах, можно сделать вывод о том, что, хотя интеграция кДНК ВИЧ-1 не приводит к появлению двуцепочечных разрывов в клеточной ДНК, процесс репарации вызванных интеграцией повреждений генома клетки по крайней мере на начальной стадии похож на процессы репарации двуцепочечных разрывов ДНК, хотя и отличается в контексте фосфорилирования p53.

Вклад авторов. А.Н. Анисенко, М.Б. Готтих – концепция и руководство работой; А.Н. Анисенко, А.А. Нефедова, И.И. Киреев – проведение экспериментов; А.Н. Анисенко, А.А. Нефедова, И.И. Киреев, М.Б. Готтих – обсуждение результатов исследования; А.Н. Анисенко, М.Б. Готтих – написание текста.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-74-10021).

Благодарности. Авторы благодарят Программу развития МГУ (ПНР 5.13) и ЦКП «Субдифракионная микроскопия и спектроскопия» НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского за предоставление доступа к оборудованию.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Авторлар туралы

A. Anisenko

Lomonosov Moscow State University

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: a_anisenko@mail.ru
Ресей, Moscow

A. Nefedova

Lomonosov Moscow State University

Email: a_anisenko@mail.ru
Ресей, Moscow

I. Kireev

Lomonosov Moscow State University

Email: a_anisenko@mail.ru
Ресей, Moscow

M. Gottikh

Lomonosov Moscow State University

Email: a_anisenko@mail.ru
Ресей, Moscow

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар