Кинетические особенности окисления метиллинолеата в мицеллах додецилсульфата натрия

Полный текст

Введение

Пероксидное окисление липидов (ПОЛ) является сложным многостадийным процессом, протекающим главным образом в липидном слое клеточных мембран [1–10]. Для выяснения детального механизма ПОЛ широко применяют окисление метиллинолеата (LH) в качестве модельной реакции [11–18]. Используемые в этих моделях поверхностно-активные вещества (ПАВ) могут быть ионогенными и неионогенными и отличаться по числу агрегации. Кроме того, некоторые ПАВ подвергаются цепному окислению по свободнорадикальному механизму [19–21]. Стадии инициирования и продолжения цепей в данной системе пространственно разделены и сопровождаются диффузией реагирующих частиц в мультифазной системе, модель которой описана Схемой 1 [21, 22].

 

Схема 1

Водная фаза:

AAPH → r^• (k_i(w)),

r^• + O_2(w) → rO₂^•_(w) (k_1(w)),

rO₂^•_(w) + rO₂^•_(w) → r O₂r_(w) + O_2(w) (k_2(w)),

HO₂^•_(w) → H⁺ + O₂^{• –} (k_3(w)),

HO₂^•_(w) + HO₂^•_(w) → H₂O_2(w) + O_2(w) (k_6(w)).

Диффузия:

r O₂^•_(w) € r O₂^•_(oil) (k_1(w-oil), k_1(oil-w)),

O_2(w) € O_2(oil) (k_2(w-oil), k_2(oil-w)),

HO₂^•_(w) € HO₂^•_(oil) (k_3(w-oil), k_3(oil-w)).

Органическая фаза:

LH + rO₂^•_(oil) → L^• + rOOH (k_1(oil)),

rO₂^•_(oil) + rO₂^•_(oil) → rO₂r_(oil) + O_2(oil) (k_2(oil)),

L^• + O_2(oil) → LO₂^• (k₁),

LO₂^• + LH → L^• + LOOH (k₂),

LO₂^• + LO₂^• → O_2(oil) + Продукты (k₃),

LO₂^• → Продукт + HO₂^•_(oil) (k₄),

HO₂^•_(oil) + LH → L^• + H₂O_2(oil) (k₅),

HO₂^•_(oil) + HO₂^•_(oil) → H₂O_2(oil) + O_2(oil) (k_6(oil)).

Здесь индексы “w” и “oil” — водная и органическая фазы, индекс “w–oil ” — обозначает диффузию частицы из водной фазы в органическую, а “oil–w” диффузию в обратном направлении.

 

Метиллинолеат практически не растворим в воде, а инициатор, преимущественно локализован в водной фазе, что существенно влияет на динамику процесса [11, 21, 22]. Значительную роль играет и pH среды [11, 22, 23]. Неоднократно отмечалась необходимость учета непрерывного изменения структуры мицелл [11, 20–22]. Особое место играет и зависимость типа обрыва цепей от соотношения концентраций мицелл, инициатора и ПАВ [11, 18–25].

Эти вопросы пока не нашли четкой трактовки и требуют дальнейшего экспериментального и теоретического исследования. Разумеется, в рамках одной статьи решить все эти проблемы невозможно. На первом этапе представляется перспективным получение новой информации по окислению метиллинолеата в мицеллах додецилсульфата натрия (SDS). Последний практически не окисляется, и имеющиеся в литературе данные требуют уточнения и дополнительного анализа. Цель настоящей работы — получение такой кинетической информации.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовались: субстрат окисления — метиллинолеат, водорастворимый инициатор — 2,2′-азобис(2-метилпропионамид) дигидрохлорид (AAPH), мицеллообразователь — додецилсульфат натрия (все производства фирмы Sigma-Aldrich (USA))

Буферные растворы получали смешением 0.05 M растворов фосфатов NaH₂PO₄ и Na₂HPO₄ производства компании Merck (Germany), предварительно очищенных от следов переходных металлов с помощью смолы Chelex-100 (Bio-Rad Labs). Растворы инициатора ААРН и SDS готовили в фосфатном буфере. Значение критической концентрации мицеллообразования для SDS составляет 8.3∙10^-3 моль/л, а число агрегации равняется 62 [11, 23].

Кинетику поглощения кислорода при окислении LH в мицеллах SDS изучали с помощью биологического кислородного монитора производства компании Yellow Springs Instruments Co. модели 5300A (USA) с электродом Кларка в качестве датчика. При этом учитывалась межфазная диффузия кислорода и его различная растворимость в органической и водной фазе [22, 24, 25]. Скорость инициирования (W_i) определяли методом ингибиторов по расходованию водо- и маслорастворимого нитроксильного радикала 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксила ( NO^•), который обрывает цепи по реакциям, как с алкильными, так и с пероксильными радикалами [1, 21, 24, 25, 27, 28]. За скоростью расходования  NO^• следили методом ЭПР (спектрометр Adani CMS8400).

Эксперименты проводили при (310.0 ± 0.1) К в термостатированной ячейке объемом 3 мл в условиях энергичного перемешивания реакционной смеси. Скорость окисления (Wo₂) измеряли по тангенсу угла наклона кинетических кривых уменьшения [O₂] в исследуемом растворе. Все первичные экспериментальные данные обрабатывались по оптимизационной программе Kinetics 2012 версии 2.0 [26].

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В литературе не раз отмечалось, что при окислении в мицеллах существенное значение имеет метод определения скорости инициирования [6, 11, 20, 21, 23]. Кроме того, не исключено участие образовавшихся гидропероксидов в вырожденном разветвлении цепей [20–21]. Поэтому для определения W_i был использован водо- и маслорастворимый радикал  NO^• (см. разд. 2). Полученные результаты приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Значения W_i при окислении LH в мицеллах SDS

Wi ∙ 109, M ∙ с-1 (±10%)
t = 10		t = 50		t = 100		t = 200
a	b	a	b	a	b	a	b
4.3	4.4	8.6	8.5	12.8	13.5	19.1	18.9

Примечания: t – промежуток времени (мин), [LH] = 5 мM, [SDS] = 100 мM; a — по расходованию  NO^•; b — по данным справочника [28].

 

Как видно из этой таблицы, значения W_i , определенные по расходованию  NO^• и рассчитанные по справочным данным, близки. Важно, что эта тенденция соблюдается и для значительных глубин превращения, когда растет концентрация LOOH. Этот факт позволяет заключить, что участие образовавшихся гидропероксидов в инициировании процесса незначительно. Это подтверждается и данными работ [11, 21, 29]: значение скорости вырожденного разветвления составило не более (1÷7) ∙ 10^–11 M ∙ с^-1, что на 1–2 порядка меньше скорости инициирования при распаде инициатора ААРН (табл.1).

На рис. 1 и 2 представлены типичные зависимости скорости окисления LH от времени при разных концентрациях LH и SDS.

 

Рис. 1. Зависимость скорости окислении метиллинолеата в мицеллах SDS от времени в фосфатном буферном растворе при рН 7.4. [ААРН] = 8 мM, [LH] = 3 мM, • — [SDS] = 100 мM, 🞓 — [SDS] = 150 мM.

 

Рис. 2. Зависимость скорости окислении метиллинолеата в мицеллах SDS от времени в фосфатном буферном растворе при рН 7.4. [ААРН] = 8 мM, [LH] = 6 мM, • — [SDS] = 100 мM, 🞓 — [SDS] = 150 мM.

 

Заметно, что кривые скорости окисления проходят через максимум (Wo₂)_max . Чем выше [SDS] при [ААРН] и [LH] = const, тем ниже Wo₂. Ранее такой эффект уже отмечался в работах [11, 18, 20]. Причиной этого является уменьшение среднего числа молекул субстрата, приходящегося на одну мицеллу, и падение вклада реакции LO₂^• + LH → L^• + LOOH в общую скорость процесса.

Типичная кинетическая кривая поглощения кислорода LH в мицеллах SDS в фосфатном буферном растворе при рН 7.4 в начальный период времени имеет линейный характер (рис. 3). Формально кинетический анализ показывает, что обрыв цепей может осуществляться по смешанному механизму (табл. 2, [11, 18, 21, 22]).

 

Рис. 3. Кинетические кривые поглощения кислорода при окислении метиллинолеата в мицеллах SDS в фосфатном буферном растворе при рН 7.4. [SDS] = 100 мM, [LH] = 5 мM, 1 — [AAPH] = 12 мM, 2 — [AAPH] = 8 мM, 3 — [AAPH] = 4 мM.

 

Таблица 2. Зависимость скорости окисления (W_О2, М · с^–1) LH в мицеллах SDS от времени окисления t в фосфатном буферном растворе, составляющем 10, 50, 100, 200, 300 и 400 мин

Wi ∙ 109*	W(10) ∙ 107	W(50) ∙ 107	W(100) ∙ 107	W(200) ∙ 107	W(300)∙107	W(400)∙107
4.35	0.80	0.84	0.88	0.89	0.88	0.78
8.55	0.91	1.13	1.37	1.61	1.55	1.20
13.15	1.65	1.79	1.91	1.95	1.74	1.27
	0.61	0.66	0.70	0.71	0.65	0.47

Примечания: [LH] = 5 мM, [SDS] = мM; в последней строке приведены значения n_i, соответветствующие скоростям окисления LH при разных значениях t.

* Средние значения W_i взяты из табл.1.

 

Для определения порядка по инициатору (n_i) зависимость W_i от Wo₂ преобразовали в двойных логарифмических координатах и вычисляли n_i по формуле lnWo₂ = n_i ⋅ lnW_i [1].

Рассчитанное по тангенсу угла наклона значение n_i варьируется от 0.61 до 0.71, что согласуется с литературными данными [11] и оцененными константами скорости [18, 27]. Подчеркнутые значения n_i при t ≥ 300 мин, вероятнее всего, объясняются тем обстоятельством, что при этих временах становится ощутимым расход субстрата и существенный вклад в процесс вносят образовавшиеся гидропероксиды. Вероятно, пероксирадикалы, ведущие цепь окисления, принимают участие как в квадратичном, так и в линейном обрыве.

Можно полагать, что квадратичный обрыв цепей может происходить как внутри мицеллы, так и при столкновении двух мицелл с образованием единой мицеллы. Первый процесс маловероятен, поскольку в одной мицелле должны оказаться как минимум два радикала (Схема 1). Полученное авторами [18] значение константы скорости квадратичного обрыва цепи в мицеллах путем компьютерного моделирования существенно ниже (приблизительно на два порядка), чем в истинных растворах. Подобные результаты получены и для окисления липосом [27]. Такая особенность объясняется тем обстоятельством, что процесс, вероятно, происходит не в органической фазе, а в результате диффузионного столкновения двух мицелл.

Конкретный механизм линейного обрыва в литературе до сих пор не установлен. Поскольку вероятность возникновения одновременно двух цепей окисления в одной мицелле пренебрежимо мала, то возрастает время жизни образовавшихся радикалов LO₂^• (Схема 1, реакция с константой скорости k₁) в органической фазе. Вероятнее всего, линейный обрыв связан с диспропорционированием LO₂^• (Схема 1, реакция с константой скорости k₄) [11, 21, 22]). Образующиеся НO₂^• выходят в водную фазу, где скорость их диспропорционирования очень низка. Формально это фиксируется как линейный обрыв цепи.

Из рис. 4 и 5 видно, что чем выше [LH], тем больше –∆[O₂], а следовательно, образуется больше гидропероксидов, приводящих к формированию смешанных мицелл, поскольку увеличивается число молекул субстрата, находящихся внутри мицеллы. Подчеркнем, что на более глубоких стадиях окисления (время ≥ 200 мин) на величину Wo₂ влияет расход субстрата, накопление и расходование гидропероксидов. Важно отметить, что SDS в отсутствие LH практически не окисляется, а измеряемая скорость сопоставима со скоростью инициирования W_i ~ 4 ∙ 10^-9 M ∙ с^-1.

 

Рис. 4. Зависимость кинетики поглощения кислорода при окислении метиллинолеата в мицеллах SDS в фосфатном буферном растворе от его концентрации при рН = 7.4, [ААРН] = 8 мМ, [SDS] = 100 мМ: • — [LH] = = 7.5 мM, 🞓 — [LH] = 5.0 мM, ▲ — [LH] = 2.5 мM.

 

Рис. 5. Кинетические кривые поглощения кислорода при окислении метиллинолеата в мицеллах SDS в фосфатном буферном растворе при рН 7.4, [ААРН] = = 8 мM, [SDS] = 150 мM: • — [LH] = 9.0 мM, 🞓 — [LH] = 6.0 мM, ▲ — [LH] = 3.0 мM.

 

В работе [11] показано, что за время порядка 100 мин концентрация образующихся гидропероксидов (LOOH) в результате окисления LH не превышает 0.5 мM. Это означает, что вклад LOOH в генерацию радикалов мал, и можно принять, что –∆[O₂] ~ [LOOH]. Поскольку скорость распада LOOH приблизительно на 1–2 порядка меньше W_i [1, 28], логично предположить, что [LOOH] на участках возрастания скорости (рис. 1 и 2) не превышает концентрации кислорода [O₂], поглощенного ко времени достижения (Wo₂)_max. Тогда по кинетике поглощения кислорода (рис. 4, 5) можно оценить количество накопившихся в мицеллах гидроперекисей без учета их распада.

Предполагается, что при окисления LH в мицеллах Triton X-100 при достижении максимальных значений Wo₂, система представляет собой смешанные мицеллы с образовавшимися гидропероксидами [20, 21]. В их гидрофобном интерьере солюбилизирован LH. То есть в процессе окисления LH распределятся по все большему объему мицеллы, и его концентрация внутри мицеллярной фазы постепенно уменьшается.

После достижения максимальных значений Wo₂ начинает снижаться. Этот эффект может быть связан не только с расходованием субстрата окисления, но и с накоплением гидроперекисей, приводящих к образованию смешанных мицелл. Весьма вероятно, что подобный процесс реализуется и в мицеллах SDS.

Влияние рН на скорость окисления LH в мицеллах SDS иллюстрируют приведенные ниже данные (37 °C):

pH 8.5 7.4 5.5

(Wо₂ )_max ∙ 10⁸, M ∙ с^-1 9.3 8.9 1.4

Заметно, что скорость процесса в щелочной среде выше, чем при рН < 7.4. Этот результат противоречит данным из [11, 23], где сообщалось, что при рН < 5 скорость окисления возрастает. В качестве причин этого различия отметим следующие.

1. В работе [11] использован водорастворимый инициатор азобис-(4-карбоксиизовалеронитрил), при распаде которого в щелочной среде равновесие смещено в сторону отрицательно-заряженных r O₂^•. Это приводит к электростатическому отталкиванию между полярными головками SDS и образующимися r O₂^•. В нашей работе водорастворимый ААРН при рН ≥ 7.4 образует радикалы r O₂^• (см. схему 1), имеющие положительный заряд. Поэтому преодоления отрицательно заряженного слоя Штерна в мицеллах SDS не существует. Пероксирадикалы инициатора нейтрализуют заряд на поверхности слоя мицеллы и уменьшают толщину ионного слоя вокруг ионных головок ПАВ, способствуя процессу мицеллизации [11, 29, 30]. Поэтому скорость при pH > 7.4 возрастает.
2. В работе [23] возрастание Wo₂ при низком pH авторы объясняют дополнительным протонированием диаминового фрагмента ААРН, что повышает степень кулоновского взаимодействия и вероятность выхода из клетки. Этот результат вызывает сомнение. Столь значительное повышение выхода радикалов из клетки противоречит теории клеточного эффекта [28]. Скорее всего, причина кроется в методе определения W_i . Скорость инициирования в работе [23] определяли методом ингибиторов (ингибитор — фенол) по скорости поглощения кислорода. Различие с нашими результатами, вероятно, объясняется тем, что в настоящей работе W_i определяли методом ЭПР по расходованию водо- и маслорастворимого нитроксильного радикала (см. разд. 2). Отметим, что в [23] значение k_i для липидрастворимого АИБН зависит от pH, хотя он находится внутри мицеллы. Однако авторы объяснения этому факту не приводят. Очевидно, что для мицеллярных растворов использование метода ингибиторов требует уточнения.

Накопление гидропероксидов внутри тех мицелл, в которых происходит окисление LH, приводит к трансформации их структуры и образованию смешанных мицелл к моменту достижения (Wo₂)_max, что влияет на объем мицеллярных агрегатов. Из рис. 1 и 2 видно, что после достижения максимума скорости поглощения кислорода снижение последней происходит с разной интенсивностью, которая зависит от условий эксперимента. Вероятно, что Wo₂ снижается из-за уменьшения концентрации LH внутри мицеллы [11, 20, 31–33]. Очевидно, что первой причиной уменьшения [LH] является его расходование в результате окисления. Второй причиной может быть увеличение V_миц, в ходе процесса окисления, что приводит к “разбавлению” метиллинолеата внутри мицеллы. Для оценки влияния параметров эксперимента на характер изменения V_миц проанализируем данные, представленные в табл. 3.

 

Таблица 3. Кинетические параметры цепного окисления LH в мицеллах SDS

[LH], мM	[SDS], мM	Wi ∙109, M ∙ с-1	n	ν	Vмиц, мкл	[O2max], мM	(Wо2)max ∙107, M ∙ с-1
2.5	100	8.55	1.55	9.70	165	0.81	0.83
3.0	150	8.55	1.24	8.89	244	0.74	0.76
3.0	100	8.55	1.86	10.99	181	0.90	0.94
5.0	100	4.35	3.1	20.46	236	1.27	0.89
5.0	100	8.55	3.1	18.24	192	1.32	1.56
5.0	100	13.15	3.1	15.59	173	1.43	2.05
6.0	150	8.55	2.48	17.66	258	1.20	1.51
6.0	100	8.55	3.72	22.57	193	1.50	1.93
7.5	100	8.55	4.65	26.90	204	1.73	2.30
9.0	150	8.55	3.72	25.73	265	1.81	2.20

Примечания: n — среднее число молекул LH, приходящихся на одну мицеллу, n — длина цепи;

n = 62 [LH] / [SDS]; ν = (Wо₂)_max /W_i .

Расчет объема мицеллярной фазы (V_миц) при (Wо₂)_max выполнен по методике, приведенной в статье [21]. Значения n, ν и V_миц рассчитаны по данным, представленным на рис. 1, 2, 4, 5.

 

Заметно, что при [LH] = 5 мM и [SDS] = 100 мM с увеличением W_i от 4.3 ∙ 10^–9 до 1.3 ∙ 10^–8 M ∙ с^–1 происходит снижение длины цепей ν с 20.46 до 15.59 и, соответственно, V_миц уменьшается с 236 до 173 мкл. Снижение длины цепей показывает, что уменьшается и число актов продолжения цепи, приходящихся на каждый радикал LO₂^•, ведущий цепь окисления.

На первый взгляд, это приведет к тому, что при меньшей длине цепи будет образовываться меньше LOOH. Но, как видно из табл. 3, [O_2max] возрастает, а следовательно, должна возрастать и [LOOH]. Однако нельзя забывать, что процесс протекает не в истинном растворе, а в гетерогенной системе, где действует целый ряд разнонаправленных факторов, связанных с распределением компонентов системы в мультифазе и участием в процессе образовавшихся гидропероксидов.

При W_i = 8.55 ∙ 10^–9 M ∙ с^-1 и [SDS] = 100 мM с увеличением [LH] от 2.5 до 7.5 мМ, объем мицеллярной фазы возрастает (с 165 до 204 мкл). Растет длина цепи (с 9.70 до 26.90), и большее число молекул LH (в среднем) находится внутри мицеллы. При этом n возрастает с 1.55 до 4.65 (табл. 3). Видно, что с увеличением [LH] возрастает и [O_2max]: с 0.81 до 1.73 мM (табл. 3). Поэтому с ростом числа молекул LH внутри мицеллы увеличивается число образующихся гидропероксидов, что приводит к увеличению V_миц. Аналогичная закономерность наблюдается и в опытах, где W_i = 8.55 ∙ 10^–9 M ∙ с^-1 и [SDS] = 150 мM, а [LH] увеличивается с 6 до 9 мM.

С изменением концентрации SDS со 100 до 150 мM, при W_i = 8.55 ∙ 10^–9 M ∙ с^–1 и [LH] = 3 мM V_миц возрастает с 181 до 244 мкл, тогда, как n и ν снижаются (табл. 3). Причиной увеличения V_миц является возрастание количества мицелл в системе вследствие увеличения концентрации ПАВ. Снижение длины цепей связано с уменьшением числа молекул LH внутри мицеллы, что, возможно, приводит и к снижению [O_2max]. Так, с увеличением [SDS] снижается и [O_2max] с 0.9 до 0.74 мM (табл. 3). Вероятно, снижение [O_2max] показывает, на сколько меньше (в среднем) образуется LOOH в тех мицеллах, внутри которых идет цепной процесс. При W_i = 8.55 ∙ 10^–9 M ∙ с^–1 и [LH] = 6 мM увеличение концентрации SDS приводит к таким же закономерностям (табл. 3).

Из приведенных результатов видно, что кинетика процесса связана не только с условиями эксперимента, но и с характером изменения объема мицеллярной фазы. Очевидно, что постепенное увеличение V_миц должно приводить к уменьшению концентрации субстрата окисления. Поэтому, если рассматривать окисляющуюся систему как совокупность микрореакторов, где происходит поглощение кислорода, то при разработке кинетической модели надо учитывать изменение концентрации реагентов не только за счет химических реакций, но и за счет изменения объема микрореактора, в котором происходит химическое превращение. При этом необходимо не только расширять применение кинетического и квантовохимического моделирования, но и использовать для установления детального механизма методы физического воздействия на систему [31–35]. Решение данной задачи открывает пути для моделирования про- и антиоксидантной активности экзогенных и эндогенных модуляторов окислительного стресса.

Авторы искренне признательны проф. О.Т. Касаикиной за плодотворную дискуссию.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российским научным фондом (грант № 14-13-00148).

Об авторах

С. В. Молодочкина

Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова

Email: pliss@uniyar.ac.ru
Россия, Ярославль

Д. В. Лошадкин

Ярославский государственный технический университет

Email: pliss@uniyar.ac.ru
Россия, Ярославль

Е. М. Плисс

Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова

Автор, ответственный за переписку.
Email: pliss@uniyar.ac.ru
Россия, Ярославль

Список литературы

Дополнительные файлы