Improvement of morphophysiological parameters of pepper after the seed pre-sowing treatment with zinc nanoparticles

Texto integral

ВВЕДЕНИЕ

Современные нанотехнологии все шире используются в различных направлениях растениеводства [1–3]. Одним из важных микроэлементов в жизнедеятельности растений является цинк. Показано, что наночастицы (НЧ) цинка влияют на прорастание семян [4, 5], стимулируют рост растений, увеличивают площадь листьев, сухую массу и урожайность кукурузы, а также биомассу корней люцерны, томатов, огурцов [6, 7]. Механизм взаимодействия НЧ с растительными клетками не совсем ясен. В частности, процессы проникновения и накопления наночастиц, биохимические и физические барьеры, предотвращающие попадание наночастиц в растительную клетку, трансформация наночастиц в растительной ткани и другие вопросы остаются без ответа. Понятно одно, что НЧ являются источником ионов металлов, которые связываются с биолигандами и белками-переносчиками и активно участвуют в метаболизме.

Эффективность действия НЧ цинка при стимуляции роста и развития у всех растений разная и зависит от концентрации металла. Особенно важным свойством НЧ цинка является их способность защищать различные растения от воздействия абиотических факторов среды, фитопатологий и вирусных инфекций через механизмы регуляции метаболизма, повышения скорости генерации адезинтрифосфата, антиоксидантной защиты [8–10]. При использовании НЧ цинка в качестве удобрения есть опасения их влияния на компоненты почвы и микробиом, а впоследствии – и на структуру растений. Токсическое воздействие наночастиц цинка оксида на растения и микробы может быть обусловлено различными механизмами, включая образование активных форм кислорода, дестабилизацию лизосом и повреждение ДНК. Это свойство наночастиц оксида цинка широко используется в пищевой промышленности при производстве упаковок. Включение наночастиц оксида цинка в системы доставки пищевых/кормовых биоактивных ингредиентов способствует повышению качества и безвредности продуктов питания, сохранности и безвредности продуктов питания [11]. В связи с этим, введение НЧ цинка в состав биопрепарата для питания растений является перспективным.

Для решения вопроса безопасности НЧ цинка в качестве удобрения предложены несколько вариантов: внекорневая подкормка, биокультивирование посадочного материала в асептических условиях и введение НЧ в покрытие для семян [12–14]. В работе рассматривается вариант предпосевной обработки семян НЧ цинка в составе полимерного покрытия. На наш взгляд, такой подход позволяет обеспечить индивидуальную доставку элемента каждому растению и экологическую безопасность.

Цель настоящего исследования – выяснение биологических последствий обработки семян наночастицами цинка в составе полимеров на морфофизиологические показатели растений перца в вегетативный период.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы

Наночастицы цинка были получены методом высокотемпературной конденсации на установке Миген-3 [15]. Исследование физико-химических характеристик НЧ цинка было проведено сотрудниками Лаборатории нано- и микроструктурного материаловедения ИНЭПХФ РАН.

Объектом исследования была выбрана культура растения перца Capsicum annuum L., сорта Задира. Для проведения предпосевной обработки семян перца была использована композиция на основе Na-карбоксиметилцеллюлозы и полиэтиленгликоля-400, в которую вводили суспензию наночастиц металлов в нужной концентрации. Подготовку биопрепаратов проводили по схеме, описанной в работе [14]. Далее семена обрабатывали полимером с НЧ цинка. Схема опытов представлена на рис. 1.

 

Рис. 1. Схема проведения опыта.

 

Для выращивания растений в подготовленные ящики с почвой раскладывали по 5 шт семян. Ящики помещали на стеллажи с контролируемым постоянным режимом: температура – 22–25 °С, влажность – 36%, освещенность – 3500–3000 люкс в режиме свет/темнота 12/12 ч/сут. Через 15 сут проверяли всхожесть семян. Через 60 сут роста и развития растений в фазе цветения оценивали следующие морфометрические показатели: высоту растений, количество листьев, длину и ширину корней, количество бутонов, сырую массу надземной части растений и корней, а также следующие биохимические показатели: содержание белка, пролина, сахара, хлорофилла А, В и общего в листьях перца.

Содержание белка в листьях определяли методом Лоури [16]. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин [16]. Свежий растительный материал (0.5 г) растирали в фарфоровой ступке с 2 мл с концентрацией фосфатного буфера 0.2 моль/л (рН 8.0). Гомогенат заливали 10 мл холодного раствора 5.0%-ной трихлоруксусной кислоты, перемешивали и помещали на 20 мин в холодильник. Далее осаждали белок центрифугированием при скорости вращения V = 6000 об./мин в течение 15 мин. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали. Осадок промывали охлажденным 96%-ным этанолом до полного исчезновения зеленой окраски надосадочной жидкости. После повторного центрифугирования к промытому осадку добавляли 2 мл раствора 0.5 н NaOH. Пробирки помещали на кипящую баню на 5 мин, приливали еще 5 мл раствора 0.5 н NaOH, перемешивали и центрифугировали в течение 10 мин при V = 6000 об./мин. Надосадочную жидкость переносили в мерный стакан и измеряли общий объем щелочного гидролизата. К 1 мл щелочного гидролизата добавляли 5 мл смеси растворов (50 частей 2%-ного Na₂CO₃ в 0.1 н NaOH + 1 часть 0.5%-ной CuSO₄ · 5H₂O в 1.0%-ном растворе виннокислого калия V = натрия) и 0.5 мл реактива Фолина. Оптическую плотность белка измеряли при длине волны λ = 750 нм.

Содержание хлорофилла в свежих листьях растений определяли при 50%-ном цветении. Оценку содержания хлорофилла проводили методами Arnon [17] и Kirh [18]. К 1 мл гомогената растертых листьев добавляли 4 мл 80%-ного (по объему) ацетона и давали постоять в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин. Далее центрифугировали при V = 2000 об./мин в течение 5 мин. Супернатант использовали для определения хлорофилла методом спектрофотометрии. Оптическую плотность хлорофилла А определяли при λ = 645 нм, хлорофилла В – при λ = 663 нм на спектрофотометре Hitachi U-3900 компании Hitachi (Japan). Концентрацию хлорофиллов рассчитывали по уравнениям для 80%-ного ацетона (по Вернону): C_хл.А = 11.63D₆₆₃ – 2.39D₆₄₅; С_хл.В = 20.11D₆₄₅ – 5.18D₆₆₃; C_{хл.А + хл.В} = 6.45D₆₆₃ + 17.7D₆₄₅, где С –концентрация хлорофилла, D – значение оптической плотности при данной длине волны.

Содержание сахара в листьях перца на стадии цветения оценивали по методу Dubo et al. [19], модифицированному Johnson et al. [20]. Свежий растительный материал (0.5 г) гомогенизировали с 10 мл дистиллированной воды. Далее центрифугировали при V = 3000 об./мин в течение 5 мин. Затем к 0.1 мл надосадочной жидкости добавляли 1.5 мл фенола. После 1 ч инкубации при комнатной температуре добавляли 5 мл концентрированной H₂SO₄. Поглощение каждого образца регистрировали при λ = 420 нм. Концентрацию определяли по калибровочной кривой.

Содержание пролина определяли с помощью нингидринового реактива (1.25 г нингидрина + 30 мл ледяной уксусной кислоты + 20 мл 6 М H₃PO₄.) по методу, описанному в работе [21]. Навеску листовой пластики (200 мг) заливали 5–20 мл кипящей дистиллированной воды и выдерживали в течение 10 мин на водяной бане при температуре 100 °С. В чистую пробирку заливали 2 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл нингидринового реактива и 2 мл приготовленного экстракта. Пробы инкубировали в течение 20 мин на водяной бане при температуре 100 °С, охлаждали при комнатной температуре и измеряли оптическую плотность при λ = 520 нм на спектрофотометре компании Hitachi U-3900 (Japan). Содержание пролина рассчитывали с помощью калибровочной кривой, используя для построения химически чистый пролин производства компании Sigma-Aldrich (USA).

Статистическую обработку данных осуществляли в программах Microsoft Excel 2010 и Statistica 20 (“StatSoft, Inc.”, USA). Определяли средние значения изучаемых показателей (М) и стандартные ошибки среднего (±SEМ). Достоверность различий между вариантами оценивали методами параметрической (t-критерий Стьюдента) статистики. Различия между вариантами считали статистически значимыми при доверительной вероятности p ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Современное развитие нанотехнологий открывает новые перспективы в совершенствовании способов выращивания овощных культур [1–3]. Один из путей получения высоких урожаев – использование высококачественного посадочного материала, который растят в асептических условиях на питательных средах с наночастицами металлов-микроэлементов вместо солей [13].

Другим вариантом использования нанотехнологий является предпосевная обработка семян наночастицами микроэлементов в составе полимерного покрытия. Идея такой обработки семян связана, во-первых, с необходимостью обеспечения каждого растения микроэлементами, а во-вторых, с предупреждением загрязнения почвы наночастицами, которые в силу своей высокой реакционной способности могут оказывать отрицательное воздействие на химический состав почвы и почвенный микробиом [22].

Используемые НЧ цинка представляют собой монокристаллические структуры круглой правильной формы. Кривая распределения наночастиц цинка лежит в области размеров в области 0–250 нм. Средний диаметр полученных частиц цинка составляет (60.6 ± 3.7) нм. Оксидных фаз методом рентгенофазового анализа не обнаружено не было (рис. 2).

 

Рис. 2. Физико-химические характеристики наночастиц цинка: а – изображение НЧ цинка, полученное методом просвечивающей электронной микроскопии; б – кривая распределения НЧ по размерам; в – рентгенограмма НЧ.

 

Для оценки влияния предпосевной обработки семян перца препаратами с НЧ цинка на продуктивность растений были измерены морфометрические показатели, представленные на рис. 3. Видно, что предпосевная обработка семян перца наночастицами цинка в концентрациях 10^–5% и 10^–6% в составе полимеров приводит к увеличению длины корней, сырой массы надземной части растений, к достоверному увеличению количества листьев и бутонов, объема корневой массы в среднем на 10–30% по сравнению с контрольными образцами – растениями, выращенными из семян, необработанных препаратами. Активное влияние НЧ цинка на вегетативный рост растений наблюдали и другие авторы. Так, при обработке семян канолы сортов Faisal canola и Shiralee опрыскиванием суспензией, содержащей наночастицы цинка в концентрации 15 мг/л, наблюдали увеличение числа побегов у Faisal canola на 25% и у Shiralee на 29% по сравнению с необработанными контрольными растениями [12].

 

Рис. 3. Изменение морфометрических показателей растений перца, выращенных из семян, обработанных препаратом с наночастицами цинка: 1 – контроль (необработанные семена); 2 – предпосевная обработка семян НЧ цинка в концентрации 10^–5%; 3 – предпосевная обработка семян НЧ цинка в концентрации 10^–6%; * — достоверность изменений по критерию Стьюдента р ≤ 0.05.

 

Ранее сообщалось о положительном влиянии НЧ цинка на рост других видов растений, что подтверждает наши выводы. Показано, что внекорневая подкормка растений наночастицами цинка увеличивает высоту побегов, длину и массу корней проса [23], биомассу корней и побегов маша, кукурузы и подсолнечника [6, 24, 25], стимулирует рост лука, нута, арахиса [26–28].

Помимо влияния наночастиц цинка на морфометрические показатели, предпосевная обработка семян перца способствует изменениям физиологической реакции растений на воздействие НЧ. Хлорофилл и каротиноиды играют незаменимую роль в процессе фотосинтеза, определяя фотосинтетическую способность растений. Содержание хлорофилла и каратиноидов может изменяться в зависимости от условий роста, состояния, здоровья и различных факторов окружающей среды [29]. При изучении влияния НЧ цинка на содержание пигментов листьев канолы [12], арахиса [28], томатов [13], фасоли [30], кинзы [31] установлена положительная тенденция в изменении содержания пигментов. Следует отметить, что эти эффекты являются дозозависимыми: в больших концентрациях, вплоть до 400 мг/л, обработка наночастицами цинка приводит к фитотоксическому действию [32].

На рис. 4 представлены данные по влиянию предпосевной обработки наночастицами цинка в составе полимеров на изменение содержания фотосинтетических пигментов листьев перца. Видно, что предпосевная обработка семян перца наночастицами цинка в составе полимеров в концентрации 10^–5% приводит к увеличению хлорофилла А на 19.5%, хлорофилла В – на 44%, общего хлорофилла – на 25% по сравнению с контрольными образцами. Предпосевная обработка семян перца НЧ цинка в составе полимеров в концентрации 10^–6% приводит к снижению содержания хлорофилла А на 55% и к достоверному увеличению хлорофилла В на 44%. Положительное воздействие препаратов цинка в концентрации 15 · 10^–3% на содержание фотосинтезирующих пигментов (хлорофилла А – на 47–50%, хлорофилла на В – на 46–54%) при обработке семян канолы наблюдали идругие исследователи [12].

 

Рис. 4. Изменение содержания хлорофилла А, хлорофилла В и общего хлорофилла в листьях перца после предпосевной обработки семян наночастицами цинка в составе полимеров: 1 – контроль (необработанные семена); 2 – предпосевная обработка семян НЧ цинка в концентрации 10^–5%; 3 – предпосевная обработка семян НЧ цинка в концентрации 10^–6%; * — достоверность изменений по критерию Стьюдента р ≤ 0.05.

 

Изменение концентрации пролина, растворимых белков и сахаров в листьях перца, выращенных из семян, обработанных НЧ цинка представлены на рис. 5. Предпосевная обработка семян препаратами с НЧ Zn в концентрациях 10^–5% и 10^–6% приводит к увеличению содержания пролина в листьях перца соответственно на 4% и 58% (р ≤ 0.05) по сравнению с контрольными растениями. Содержание сахара достоверно увеличивается на 36% в листьях при обработке семян НЧ цинка в концентрации 10^–5%. Содержание белка в листьях перца увеличивается на 12 и 20% (р ≤ 0.05) при обработке семян НЧ цинка соответственно в концентрациях 10^–5% и 10^–6% по сравнению с контрольными растениями. Однако наблюдаемые морфофизиологические показатели растения перца далеки от объяснения механизмов воздействия НЧ цинка. В этом отношении особое место занимает исследование авторов по оценке протеома и скорости экспрессии гена при обработке семян НЧ цинка. Протеомный анализ и анализ экспрессии генов листьев растений, семена которых были обработаны НЧ цинка, показал, что НЧ обладают способностью влиять на уровни белка и транскрипцию генов, что может объяснить причину изменения морфологических и физиологических параметров [12]. Отсутствие достаточного экспериментального материла, ограниченное число публикаций об участии наночастиц цинка в экспрессии генов, связанных с ростом и продуцированием, не позволяет понять молекулярную роль этих НЧ в физиологических процессах растений. Работы в этом направлении будут продолжены.

 

Рис. 5. Изменение содержание пролина, растворимых сахаров и белка в листьях растения перца после предпосевной обработки семян наночастицами цинка в составе полимеров: 1 – контроль (необработанные семена); 2 – предпосевная обработка семян НЧ цинка в концентрации 10^–5%; 3 – предпосевная обработка семян НЧ цинка в концентрации 10^–6%; * — достоверность изменений по критерию Стьюдента р ≤ 0.05.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование передовых технологий в растениеводстве позволит решить важнейшую продовольственную проблему. Предложено проводить предпосевную обработку семян перца наночастицами цинка в составе полимерного покрытия. Такой способ позволит обеспечить жизненно необходимым микроэлементом каждое растение и обезопасить почву от загрязнения наночастицами. Проведенные исследования свидетельствуют об улучшении морфометрических показателей растения перца в вегетативный период, а также о повышении содержания фотосенсизирующих пигментов, белка, пролина, сахара в листьях растений. Такие изменения морфофизиологических параметров растений являются предпосылкой для увеличения урожайности перца.

Исследование было поддержано грантом Российского научного фонда № 22-26-00109.

Sobre autores

I. Olkhovskaya

Semenov Federal Research Center for Chemical Physics of the Russian Academy of Sciences

Email: nnglu@mail.ru
Rússia, Moscow

I. Krokhmal

Semenov Federal Research Center for Chemical Physics of the Russian Academy of Sciences; State Autonomous Cultural Institution of the City of Moscow “Zaryadye Park”

Email: nnglu@mail.ru
Rússia, Moscow; Moscow

N. Glushchenko

Semenov Federal Research Center for Chemical Physics of the Russian Academy of Sciences

Autor responsável pela correspondência
Email: nnglu@mail.ru
Rússia, Moscow

Bibliografia

Arquivos suplementares