Сравнительное определение иммунологических показателей для оценки фантомных болей

Полный текст

Синдром фантома с болью относится к одному из самых сложных хронических болевых синдромов, с трудом поддающемуся терапии. По данным исследований, фантомные боли возникают у 50–80% пациентов после ампутации конечностей [1–3]. Понимание механизмов развития фантомного болевого синдрома (ФБС) постоянно трансформируется. Предположение о главенствующей роли неврином, образующихся на концах пересеченных нервов, не оправдалось, поскольку их удаление не оказывало существенного лечебного эффекта. Следующая теория, предполагающая ответственными за генерацию болевых импульсов спинальные нервы, была опровергнута безрезультатностью операций по перерезке указанных нервных стволов [4, 5]. Сложности лечения обусловливают высокую актуальность создания новых способов объективной диагностики и профилактики фантомов. Это позволит отслеживать динамику болевого синдрома, эффективность лечебного процесса. В настоящее время существующие методы оценки болевых ощущений подразделяют на “субъективные” (различные опросники), “субъективно-объективные” (алгометрия) и “объективные”. Это – электрофизиологические методы, “визуализация” боли с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ), биохимические методы [6]. ФБС имеет хроническое продолжительное течение, является следствием нарушений механизмов поддержания гомеостаза организма, который на молекулярном уровне характеризуется состоянием системы эндогенных биорегуляторов (ЭБ), обеспечивающих биохимическое равновесие [7]. Этот процесс сопровождается нейроиммунным взаимодействием, основанным на связи механизмов регуляции болевой чувствительности, и работой иммунокомпетентных клеток организма [7–9]. В последнее десятилетие накоплен значительный фактический материал, который убедительно свидетельствует о существенной роли иммунологических механизмов в развитии болевых синдромов [10]. Изменение иммунологических показателей, специфических естественных антител к ряду эндогенных биорегуляторов (ЭБ) происходит при дорсалгиях различного генеза [11]. В настоящее время разработаны аналитические методы измерения уровня естественных антител (е-Ат), характеризующих состояние системы эндогенных биорегуляторов, участвующих в молекулярных механизмах, которые обеспечивают биохимическое гомеостатическое равновесие [7]. Совокупность е-Ат отражает и регулирует индивидуальный молекулярно-клеточный состав организма. Их содержание находится в прямой зависимости от уровня эндогенных мишеней. Установлено, что свойства указанных иммунологических маркеров претерпевают изменения в качественном и количественном отношении, на самых ранних стадиях возникновения заболевания [7, 12, 13]. Определение факторов нейрогуморальной регуляции, участвующих в передаче болевого сигнала, является перспективной основой для разработки диагностического метода объективизации боли.

Цель работы заключалась в определении иммунологических маркеров – уровня естественных антител к регуляторам основных биохимических систем, включая торможение и возбуждение, опиатной и антиопиатной, биогенных аминов, ренин-ангиотензиновой, белкам гемостаза в сыворотке крови лиц, страдающих фантомным болевым синдромом, полученным при хирургической ампутации после минно-взрывного ранения установлении прогностической роли данных показателей в объективизации болевого статуса пациента.

МЕТОДИКА

Настоящая работа была выполнена на базе клинико-диагностической лаборатории “ДИАНАРК” г. Москвы (лицензия № ЛО41-01137-77/00369646 от 09.12.2014 г). Материалы для исследования предоставлены госпиталем ФГБУ “НМИЦ ВМТ им. А. А. Вишневского” МО России (г. Красногорск). Было проведено обследование 14 пациентов-военнослужащих в возрасте от 29 до 37 лет (средний возраст 32.0 ± 0.7 года), проходивших лечение после полученного в результате боевых действий минно-взрывного ранения (6–8 мес. назад), приведшего к ампутации конечности. В последующем проведенная хирургическая операция вызвала у пациентов развитие фантомных болей различной степени тяжести. В данный момент пациенты находятся на стадии подготовки к протезированию. Оценку степени болевого синдрома, проводили по визуально-аналоговой шкале ВАШ, с учетом субъективных данных обследованных пациентов [6]. На отрезке прямой с 10 делениями больные отмечали интенсивность боли. Ноль соответствовал полному отсутствию боли, слабая боль – 0–2 балла, умеренная боль – 2.1–4 балла, сильная боль – 4.1–6 баллов, сильнейшая боль – 6.1–8 баллов, невыносимая боль – 8.1–10 баллов.

Забор образцов крови для анализа (5 мл) осуществляли у всех пациентов при поступлении в стационар на госпитализацию. Для получении сыворотки пробирки с образцами центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об./мин (центрифуга Centrifuge CM-6M, ELMILtd, Латвия). Далее образцы крови хранили при температуре –20 °С до момента тестирования. Для сравнения показателей использовали группу контроля из 14 здоровых человек, не испытывающих симптомы болевого синдрома, одинакового возраста с обследуемыми участниками эксперимента. При проведении иммунохимических исследований применяли твердофазный метод иммуноферментного анализа (ИФА) определения антител к регуляторам основных систем биохимического гомеостаза (β-эндорфину, серотонину, дофамину, гистамину, орфанину, ангиотензину, ГАМК, глутамату, брадикинину, вазопрессину, тромбину, α2-макроглобулину) в сыворотке крови человека. Метод включает следующие этапы: иммобилизацию комплекса синтетического антигена, состоящего из коньюгата производного указанного выше гаптена с полимерным носителем на полистирольном планшете (Nunc, Дания); последующее связывание полученного антигена со специфическими антителами анализируемого образца; выявление образовавшегося иммунного комплекса с помощью антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена; измерение ферментативной активности в образовавшемся иммунном комплексе. Для проведения ИФА использовали “Набор реагентов для иммуноферментного определения антител к эндогенным биорегуляторам в сыворотке крови “АДИМУСТАТ®” (РУ № РЗН 2022/19268, “ДИАНАРК”, Россия). Синтез конъюгированных антигенов и условия проведения анализа выполняли в соответствии с разработанной нами ранее схемой [14].

Статистическую обработку результатов выполняли с применением пакета программ SPSS 19.0 для научных исследований. Для оценки результатов выбрали значение величины средней арифметической (М), стандартной ошибки (m). Использовали при обработке данных критерии Пирсона, Стьюдента–Уэлча (t). Гипотезы принимали с достоверностью 95% (р = 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведено определение иммунологических показателей, отражающих функциональное состояние регуляторов биохимического гомеостаза, в группе обследованных пациентов-военнослужащих, находящихся на лечении после полученного минно-взрывного ранения, приведшего к ампутации конечности. Выбранные для анализа эндогенные молекулы являются универсальными маркерами психофизиологического здоровья человека, а отклонение их уровня от нормы может свидетельствовать о текущем состоянии и рисках начала заболевания.

Установлено, что изменение уровней специфических антител к эндогенным регуляторам (β-эндорфину, серотонину, дофамину, гистамину, орфанину, ангиотензину, ГАМК, глутамату, брадикинину, вазопрессину, тромбину, α2-макроглобулину) является индивидуальным, и каждый пациент обладает характерным иммунопрофилем (табл. 1).

 

Таблица 1. Результаты иммуноферментного анализа (ИФА) определения уровня естественных антител (е-Ат) в группе обследованных пациентов

Пациент № п/п	Показатели уровня естественных антител (ОП450 ИФА) в сыворотке крови обследуемых пациентов
	β-эндорфин	Серотонин	Дофамин	Гистамин	Орфанин	Ангиотензин II	ГАМК	Глутамат	Брадикинин	Вазопрессин	Тромбин	α2-макроглоб
№ 1	0.87	1.38**	0.98*	0.97*	1.23**	1.15*	0.97	1.02	0.97	0.89	0.97	0.89
№ 2	0.87	1.46**	1.12*	1,05*	1.13*	1.25*	1.22*	1.25*	0.81	0.92	1.09*	0.85
№ 3	1.28**	1.93**	1.64**	1.31**	1.45**	1.64*	1.43*	1.46*	1.55*	1.48*	1.61**	1,38*
№ 4	0.91*	1.45**	1.09*	1.11*	0.97	1.23*	1.14*	1.17*	0.92	0.89	1.01*	0.87
№ 5	0.88	1.74**	1.38**	1.37**	1.52**	1.41*	1.51**	1.62*	0.99	1.02*	1.09*	0.89
№ 6	1.81**	2.31**	1.89**	2.11**	1.89*	2.29*	2.22*	1.99**	1.02*	1.15*	1.07*	1.21**
№ 7	0.61	1.11*	0.89	0.69	0.65	0.78	0.85	0.91	0.73	0.78	0.86	0.74
№ 8	0.75	1.16*	0.89	0.97*	0.96	1.02*	0.96	0.96	0.81	0.87	0.91	0.88
№ 9	0.91*	1.42**	0.96	1.18*	0.86	0.95*	0.98	1.07	0.93	0.95	0.97	0.91
№ 10	0.48	0.64	0.71	0.73	0.66	0.66	0.91	0.73	0.68	0.81	0.91	0.73
№ 11	0.91*	1.69**	1.53**	1.09**	1.14**	1.79**	1.21**	1.31**	0,87	0.93	0.97	0.94
№ 12	0,79	1.49**	1.14**	0.99*	0.91	1.16**	0.61	0.93	0.89	0.78	0.93	0.75
№ 13	0.61	1.21**	0.96	0.89	0.79	1.01**	0.81	0.81	0.77	0.91	0.94	0.79
№ 14	0.66	1.01**	0.95	0.76	0.82	1.23**	0.86	0.93	0.98	1.01**	0.99	0.93
Группа контроля, n = 10	0.59 ± 0.17	077 ± 0.18	0.79 ± 0.15	0.62 ± 0.16	0.84 ± 0.14	0.62 ± 0.18	0.91 ± 0.15	0.92 ± 0.16	0.71 ± 0.15	0.72 ± 0.17	0.81 ± 0.13	0.69 ± 0.18

Примечание: ОП – оптическая плотность. ^* – р < 0.05; ^**– p < 0.01 по отношению к норме.

 

В механизмах развития боли участвуют медиаторные системы моноаминовой природы [15, 16]. Так, для всех обследованных лиц отмечено достоверное увеличение уровня е-Ат к серотонину. В случае гистамина исключением являются результаты анализа пациентов № 7, 13 и 14, для которых отмечена лишь тенденция к повышению. Показатель е-Ат к дофамину увеличен только для пациентов № 1–6, 11 и 12, а для остальных лиц изменения не достоверны.

Ряд эндогенных биорегуляторов, такие как пептиды орфанин и β–эндорфин, связаны с передачей болевого сигнала и относятся к ноцицептивной (НЦС) и антиноцицептивной (АНЦС) системам [17]. У пациентов обследованной группы отмечено достоверное повышение уровня е-Ат к орфанину для лиц группы № 1–6 и 11, а для показателя е-Ат к β-эндорфину достоверное увеличение наблюдали лишь у пациентов № 3, 4, 6, 9 и 11.

Для половины пациентов обследуемой группы № 2–6 и 11 обнаружено увеличение значений показателей е-Ат тормозных и возбуждающих медиаторов (ГАМК и глутамат), которые влияют на проводимость болевого импульса и обеспечивают энергетический ресурс организма. Учитывая тесную связь биохимических превращений указанных веществ при метаболизме, положительным является факт сбалансированного одновременного изменения этих показателей.

Проведенный анализ иммунологических показателей для пептидов ренин-ангиотензиновой системы позволил установить наиболее значимые изменения для уровня е-Ат к ангиотензину для всех обследованных лиц за исключением пациента № 7. Эндогенный регулятор ангиотензин может модулировать восприятия боли, за счет изменения стенки сосудов. В случае брадикинина, являющегося одним из медиаторов боли и воспаления, достоверное увеличение е-Ат наблюдали для пациентов № 3 и 6. Для показателей е-Ат к вазопрессину получены результаты аналогичные для е-Ат к брадикинину, которые лишь дополняет пациенты № 5 и 14. Для белков регуляторов гемостаза отмечено повышение уровня е-Ат в случае тромбина у пациентов № 2-6, а в случае α2-магроглобулина – № 3 и 6.

Таким образом, на данном этапе исследования для оценки “болевого статуса” пациентов наиболее информативными являются результаты ИФА определения следующих иммунологических показателей – е-Ат к: дофамину, серотонину, гистамину, β-эндорфину, ГАМК, глутамату, ангиотензину II, орфанину.

Для оценки интенсивности выраженности боли провели сравнительный анализ уровня е-Ат и показателей шкалы самооценки ВАШ.

Иммунологические показатели для исследуемых е-Ат рассчитаны в процентах, и представлены как разница отклонения значений оптической плотности (ОП) в ИФА от контрольных величин у каждого обследованного пациента. Показатели шкалы ВАШ выражены в баллах (табл. 2).

 

Таблица 2. Сравнение показателей шкалы ВАШ с результатами иммуноферментного анализа (ИФА) в обследованной группе пациентов

Пациент № п/п	Показатель ВАШ (бал)	Иммунологический показатель (отклонения в %)
		Дофамин	Серотонин	Гистамин	β-эндорфин	ГАМК	Глутамат	Ангиотензин II	Орфанин
№ 1	6.1–8	13.9↑	55.1↑	40.6↑	29.8↑	N	4.1↑	61.9↑	32.3↑
№ 2	0–2	30.2↑	64.0↑	52.2↑	29.8↑	23.2↑	27.5↑	76.1↑	21.5↑
№ 3	0–2	90.7↑	116.8↑	89.9↑	91.0↑	44.4↑	48.9↑	130.9↑	55.9↑
№ 4	2.1–4	26.7↑	62.9↑	60.9↑	35.8↑	15.1↑	19.4↑	73.2↑	4.31↑
№ 5	2.1–4	60.5↑	95.5↑	98.5↑	31.3↑	52.5↑	65.3↑	98.6↑	63.4↑
№ 6	0–2	119.8↑	159.5↑	205.8↑	170.1↑	124.2↑	103.1↑	222.5↑	103.2↑
№ 7	2.1–4	3.5↑	24.7↑	N	N	N	N	9.1↑	14.6↓
№ 8	4.1–6	4.5↓	6.0↓	10.3↑	8.0↓	7.3↓	8.3↓	4.9↓	7.3 ↓
№ 9	0–2	11.4↑	59.5↑	71.0↑	35.8↑	N	9.2↑	33.8↑	N
№ 10	2.1–4	2.74↑	14.67↓	5.8↑	9.43↓	N	12.05↓	N	13.16↓
№ 11	0–2	77.91↑	89.89↑	57.97↑	35.82↑	22.22↑	33.67	152.11↑	22.58↑
№ 12	6.1–8	32.56↑	67.42↑	43.48↑	17.91↑	28.24↓	N	63.38↑	N
№ 13	2.1–4	11.63↑	35.96↑	28.99↑	N	N	N	42.25↑	N
№ 14	2.1–4	10.47↑	13.48↑	N	N	N	N	73.24↑	N

Примечание: ↑ – увеличение показателя при сравнении со значениями контроля; ↓ – снижение показателя при сравнении со значениями контроля. N – не отличается от нормы.

 

Согласно шкале самооценки, для обследованных лиц зарегистрирован различный уровень чувствительности к фантомной боли. У пациентов № 1 и 12 отмечена сильнейшая боль, далее пациенты № 4, 5, 7, 10, 13, 14 характеризовались показателем умеренной боли, а для пациента № 8 отмечена сильная боль, оставшиеся пациенты № 2, 3, 6, 9, 11 имели слабую боль или ее отсутствие.

Анализ представленных в табл. 2 данных показал, что для пациентов № 1 и 10 с высоким уровнем ФБС наиболее значимыми являются показатели для е-Ат к серотонину и ангиотензину. При снижении проявления ФБС (пациент № 8) отмечается небольшое по сравнению с нормой понижение колебаний по всем исследуемым иммунологическим показателям. Для пациентов № 4, 5, 7, 10, 13, 14, имеющих умеренный ФБС, установлено, что показатели е-Ат могут быть либо одновременно повышены для моноаминовой (серотонин, гистамин, дофамин) и ренин-ангиотензиновой (ангиотензин) системы, либо, в случае пациентов № 7, 13, 14, показатели близки к норме. При слабом проявлении ФБС (пациенты № 2, 3, 6, 9 и 11) наиболее значимым является уровень е-Ат к гистамину, серотонину и ангиотензину. Изменение показателей е-Ат к орфанину и β–эндорфину, участвующих в регуляции НЦС и АНЦС, обнаружено для пациентов № 3 и 6, с низким уровнем ФБС.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для оценки развития фантомного болевого синдрома проводили определение иммунологических показателей, включающее иммуноферментное измерение е-Ат к эндогенным медиаторам, участвующих в регуляции передачи болевого импульса. По современным научным представлениям, антитела к эндогенным регуляторам боли рассматриваются как фактор обратной связи взаимодействия центральной нервной системы (ЦНС) и иммунной системы [18]. С помощью специфичных антител происходит иммуномодуляция активности системы болевой проводимости [13]. Известно, что хроническую боль сопровождают стресс и эмоциональное напряжение. Они вызывают повышение секреции биогенных аминов в крови, которые играют ведущую роль в патогенезе болезненных и стрессовых состояний [19, 20]. Установлено, что концентрация серотонина обратно пропорциональна интенсивности хронической боли, уровень дофамина и серотонина повышается после курса массажа у пациентов с болями. Эксперименты на животных показали, что гистамин играет важную роль при спонтанной невропатической боли [12, 13, 15, 16]. Согласно результатам проведенного исследования, содержание специфических антител к серотонину, гистамину повышено у всех обследованных лиц, а для дофамина достоверное изменение выявлено у пяти пациентов, для остальных отмечена тенденция к повышению уровня е-Ат. По-видимому, такое распределение связано с индивидуальной психоэмоциональной реакцией на уровень боли и эффективность его купирования. Подтверждением этому служат литературные данные об увеличенной продукции катехоламинов при болевом синдроме и снижении их выработки после противоболевой терапии [12, 13]. Полученные данные свидетельствует о том, что у обследованных пациентов уже сформировался дисбаланс медиаторов, и иммунная система ответила на это повышенной продукцией е-Ат к регуляторам боли.

В норме возникающая боль эффективно контролируется эндогенными механизмами НЦС и АНЦС, представителями которых являются пептиды [21, 22]. Нейропептид β-эндорфин образуется в клетках ЦНС, являясь эндогенным лигандом опиоидных рецепторов, участвует в устранении отрицательных эмоций и боли. Орфанин принадлежит к классу опиоидных пептидов, обеспечивает анальгезию в спинном мозге, регулирует высвобождение гормонов гипофиза в покое и при стрессе. Обнаружены изменения содержания в крови регуляторных пептидов: β-эндорфина, орфанина у людей, страдающих различными формами болевого синдрома [12, 18]. Анализируя полученные в работе результаты, можно отметить, что у половины обследованных пациентов в сыворотке крови происходит в различной степени повышение уровня антител к β-эндорфину, орфанину, но процесс не сопровождается одновременным изменением двух показателей. В физиологических условиях система, проводящая боль, сбалансирована комплексом противоболевой системы. Они функционируют содружественно и контролируют активность структур, участвующих в восприятии, проведении и анализе болевых сигналов. Активизация НЦС под влиянием многообразных ноцицептивных раздражителей всегда стимулирует АНЦС, что ограничивает болевое ощущение и многочисленные поведенческие, вегетативные и метаболические реакции организма, способствуя более быстрому и эффективному восстановлению нарушенных структур и функций [18]. Индивидуальные различия в изменении иммунологических показателей для β-эндорфина, орфанина в обследованной группе пациентов свидетельствует о дисбалансе в системах.

Фантомная боль является сложным патологическим комплексом, в который вовлекаются периферические, спинальные и центральные отделы нервной системы [2, 23]. Значительная роль в этом процессе принадлежит перевозбуждению центральных нервных структур. Для половины пациентов обследуемой группы № 1–5 обнаружено увеличение значений показателей е-Ат тормозных и возбуждающих медиаторов (ГАМК и глутамат), которые участвуют в проводимости болевого сигнала [12, 18, 24]. Важно отметить, что оба показателя имеют однонаправленное изменение, это связано с их метаболизмом. Данный положительный факт свидетельствует о сбалансированности работы систем торможения и возбуждения.

Характерным показателем для всех пациентов обследованной группы является достоверное увеличение уровня антител к ангиотензину. Согласно литературным данным, ренин-ангиотензиновая система принимает определенное участие в реализации восприятия боли. Изучение связи болевой чувствительности у здоровых людей с наличием редких вариантов генов показало, что в значительной мере они принадлежат ангиотензинэргической системе [25, 26]. Пептиды брадикинина и вазопрессина являются биологически активными молекулами, участвующими в проводимости болевой пульсации при воспалении. Известно, что брадикинин активирует сигнальный каскад, приводящий к возникновению боли при травме [27]. В плане регуляции кровяного давления физиологическая функция этих пептидов связана с ангиотензином. К указанным ранее регуляторам обнаружено увеличение уровня е-Ат лишь у незначительного числа обследованных лиц. Аналогичные данные получены и для белков регуляторов гемостаза. Результаты эксперимента свидетельствуют о неоднородной вовлеченности различных систем биохимической регуляции развития болевого синдрома. Это может быть связано с индивидуальными особенностями организма, длительностью болевого процесса и возможной степенью компенсации иммунологическими механизмами.

В настоящее время для оценки выраженности боли используют различные шкалы самооценки боли. Их легко, быстро и просто применять на практике. Однако эти методы являются субъективными, так как отражают общее восприятие боли пациентом, не выделяют ноцицепцию как таковую и не учитывают вклада других систем. Проводя оценку роли регуляторов той или иной системы биохимического гомеостаза в развитии фантомных болей, можно предположить, что при высокой, умеренной и слабой степени выраженности ФБС активированы системы биогенных аминов и ангиотензинэргическая. По мере снижения интенсивности ФБС отмечена нормализация отклонения иммунологических показателей для всех исследуемых регуляторов. Изменения показателей НЦС и АНЦС наиболее значимо только при низком ФБС. Исследования последних лет показывают, что при развитии боли происходит множество реакций, не осознаваемых человеком, которые в итоге влияют как на интенсивность боли, так и на процесс ее хронизации. Важная роль при этом отводится нейроиммунным взаимодействиям. Также отмечается, что выраженность боли, оцененная по различным шкалам, может не иметь связи со степенью дисбаланса этих систем, с нейрофизиологическими и другими характеристиками проявления боли.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе исследования выявлены особенности распределения иммунологических показателей е-Ат к регуляторам основных систем биохимического гомеостаза. Установлено, что каждый обследуемый пациент обладает индивидуальным иммунопрофилем, но для всех участников эксперимента характерно увеличение уровня е-Ат к серотонину, гистамину и ангиотензину. Определение указанных показателей отражает хронизацию болевого синдрома, но не зависит от самооценки степени выраженности фантомной боли. Мониторинг индивидуального профиля е-Ат к эндогенным регуляторам позволяет получить объективную картину болевого статуса организма пациента, а это в свою очередь даст возможность выбора эффективной, персональной лечебной программы.

Финансирование работы. Работа выполнена в соответствии с исследованием согласно Госрегистрации № 01200952666.

Соблюдение этических стандартов. Все исследования проводились в соответствии с принципами биомедицинской этики, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 г. и последующих поправках к ней. Они также были одобрены локальным Биоэтическим комитетом Института физиологически активных веществ РАН (Черноголовка, Московская область), протокол № 396/10 от 25.10.2023 г.

Каждый участник исследования дал добровольное письменное информированное согласие после получения разъяснений о потенциальных рисках и преимуществах, а также о характере предстоящего исследования.

Конфликт интересов. Авторы работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Об авторах

М. А. Мягкова

Институт физиологически активных веществ Федерального исследовательского центра проблем химической физики и медицинской химии РАН

Email: dianark777@mail.ru
Россия, Черноголовка, Московская обл.

З. В. Боброва

Институт физиологически активных веществ Федерального исследовательского центра проблем химической физики и медицинской химии РАН

Email: dianark777@mail.ru
Россия, Черноголовка, Московская обл.

С. Н. Петроченко

Институт физиологически активных веществ Федерального исследовательского центра проблем химической физики и медицинской химии РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: dianark777@mail.ru
Россия, Черноголовка, Московская обл.

А. С. Крылов

ООО “ДИАНАРК”

Email: dianark777@mail.ru
Россия, Москва

И. А. Мосейкин

Российская медицинская академия последипломного образования

Email: dianark777@mail.ru
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы