Роль кальций-зависимой десенситизации в потенциации GNE-9278 токов NMDA рецепторов нейронов коры крыс in vitro

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Для компенсации недостатка функций NMDA рецепторов в ЦНС на фоне деменций большой интерес представляют положительные аллостерические модуляторы (ПАМ). Известные ПАМ увеличивают амплитуду интегральных ионных токов, переносимых NMDA рецепторами, однако не влияют на кальций-кальмодулин зависимую десенситизацию последних. Мы изучили возможность модуляции десенситизации NMDA рецепторов недавно синтезированным ПАМ GNE-9278, имеющим уникальный сайт связывания на трансмембранном домене. Эксперименты проводили на нативных NMDA рецепторах, экспрессированных в нейронах неокортекса крысы в первичной культуре ткани. Методом “patch-clamp” регистрации трансмембранных токов проведено сравнительное изучение влияния на десенситизацию NMDA рецепторов трех веществ, потенцирующих токи NMDA рецепторов: GNE-9278 (10 мкМ), дитиотреитола (1 мМ) и ионов меди (5 мкМ). Эти вещества увеличивали амплитуду токов, вызванных 100 мкМ NMDA, однако только GNE-9278 уменьшал разницу между равновесной и пиковой амплитудами токов на 15%. Кроме того, GNE-9278 вдвое увеличивал постоянную времени спада от пика к равновесному состоянию, т.е. ослаблял десенситизацию NMDA рецепторов. Поскольку GNE-9278 не изменял эффективную концентрацию внеклеточного кальция для генерации десенситизации, его эффект вероятно не мешает взаимодействию рецептора с кальмодулином. Анализ формы токов в рамках кинетической модели показал, что GNE-9278 уменьшает два кинетических параметра: скорость закрывания канала, определяющую время открытого состояния, а также скорости входа в и выхода рецептора из десенситизированного состояния, определяющие вероятность открытого состояния канала. Модуляция кальций-зависимой десенситизации NMDA рецепторов выделяет GNE-9278 среди других известных ПАМ, что вероятно определяется сайтом связывания GNE-9278 в сегменте пре-M1 GluN1 субъединицы.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

NMDA-(N-метил-D-аспартат) рецепторы принадлежат к одному из подтипов ионотропных рецепторов глутамата, выполняющих функции возбуждающей синаптической передачи в ЦНС млекопитающих. При активации через ионные каналы этих рецепторов в клетку наряду с ионами натрия входит кальций, что играет ключевую роль в механизмах синаптической пластичности. При этом NMDA-рецепторы подвержены кальций-кальмодулин-зависимой десенситизации (КЗД), проявляющейся в постепенном уменьшении интегрального трансмембранного тока через каналы при постоянном действии агониста. Существует также глицин-зависимая десенситизация NMDA-рецепторов, наблюдаемая при дефиците ко-агониста глутамата глицина [см. обзор 1]. Oднако, при насыщаюших сайт связывания концентрациях глицина, ее эффект (вклад в падение амплитуды токов в экспериментальных условиях) многократно слабее, чем для КЗД. Поэтому при дальнейшем изложении под десенситизацией рецепторов мы будем подразумевать именно кальций-зависимый процесс десенситизации. Этот механизм ограничивает избыточное поступление ионов в нейроны, ограничивая нейротоксический эффект избыточной активации. КЗД возникает в результате связывания комплекса кальций-кальмодулин (CaCam) с внутриклеточным доменом GluN1 субъединицы рецептора [2], а её выраженность прямо пропорциональна входу ионов кальция через каналы активированных рецепторов и накоплению внутриклеточного кальция.

КЗД может модулироваться внешними факторами, влияющими на концентрацию свободного кальция в примембранной области цитоплазмы за счет буферизации, диффузии и локального транспорта соседними с рецептором белками [см. обзор 3]. В частности, натрий-кальциевый обменник модулирует КЗД за счет удаления кальция из примембранной области цитоплазмы [4, 5]. На процесс КЗД также влияют другие белки ассоциирующие кальмодулин [6]. К структурным детерминантам, влияющим на кинетику КЗД можно отнести мутации N-терминального домена GluN1 субъединицы [7], и разницу в субъединичном составе рецепторов [8].

Для компенсации дефицита функций NMDA-рецепторов на фоне деменций большой интерес представляют положительные аллостерические модуляторы (ПАМ) [9]. Хорошо изучена положительная аллостерическая модуляция полиаминами [10, см. обзор 11] и нейростероидами [12, 13], которые являются эндогенными факторами, регулирующими синаптическую передачу. Токи, опосредуемые активацией NMDA-рецепторов, возрастают в результате фосфорилирования [14, 15]. Потенциирование токов NMDA-рецепторов происходит также при действии сероводорода, дитиотреитола (DTT) и ионов меди – редокс агентов, вызывающих химическое восстановление дисульфидных связей, что вызывает разрыв последних [16 – 19].

Несмотря на то, что известные ПАМ увеличивают токи через NMDA-рецепторы, среди них обнаружено только одно вещество, потенцирующий эффект которого на токи связан с ослаблением КЗД [20] Для остальных веществ, вызывающих потенцирование токов NMDA-рецепторов такой эффект не выявлен. В частности, КЗД не ослабляется при действии таких редокс агентов, как дититотреитол [19], сероводород [21], глутатион [16]. Причем два последних являются эндогенными модуляторами функций NMDA-рецепторов [16, 22, 23]. Хотя действие редокс агентов неспецифично в отношении NMDA-рецепторов, они проявляют свойства ПАМ последних, что имеет существенное физиологическое значение.

Известно, что большинство ПАМ действуют на лиганд-связывающий домен или другие структурные элементы NMDA-рецепторов, не участвующие в КЗД. Например, прегненолон-сульфат [24] вызывает увеличение токов NMDA-рецепторов, связываясь в области трансмембранного домена, и не ослабляет КЗД. Для многих других ПАМ этот аспект влияния на токи NMDA-рецепторов не изучался.

Недавно синтезирован новый ПАМ GNE-9278 с уникальным сайтом связывания на внеклеточной поверхности трансмембранного домена NMDA-рецептора [25]. Он не является специфичным в отношении определенного субъединичного состава NMDA-рецепторов. Структурные детерминанты (T550 и D552) на сегменте пре-M1 GluN1 субъединицы вероятно определяют связывание GNE-9278 [25], причем именно этот сегмент претерпевает существенные конформационные изменения в присутствии CaCam [26]. Это заставляет предполагать возможное влияние GNE-9278 на процесс КЗД.

Поскольку в настоящее время известен только один низкомолекулярный фармакологический агент, ослабляющий КЗД NMDA-рецепторов [20], было решено исследовать, может ли и GNE-9278 влиять на этот процесс. Эксперименты проводили на нативных NMDA-рецепторах, экспрессированных в нейронах коры головного мозга, и содержащих наряду с GluN1 только GluN2A и GluN2B субъединицы [27, 28]. Такой субъединичный состав определяет выраженную подверженность этих рецепторов КЗД [8]. На нейронах в первичной культуре коры большого мозга крыс мы провели сравнительное изучение влияния на КЗД NMDA-рецепторов трех ПАМ: GNE-9278, дитиотреитола и ионов меди.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на первичной культуре нейронов коры большого мозга, полученного из эмбрионов крыс линии Вистар. Методика приготовления первичной культуры ткани нейронов коры мозга крыс детально была описана ранее [23]. На 16–17 дни пренатального развития (E16–E17) выделяли ткань неокортекса и культивировали при 37°C и 5% CO2 в нейробазальной питательной среде (ПанЭко, Россия) с ростовой добавкой B-27 (ПанЭко, Россия) на покровных стеклах, покрытых поли-D-лизином. Эксперименты на нейронах проводили на 10–14 дни культивирования.

В опытах применяли внеклеточный раствор следующего состава (мМ): NaCl 144, KCl 2.8, HEPES 10, (pH 7.2–7.4, доводили NaOH), осмолярность 310 мОсм. Если не указано иное, то концентрация CaCl2 в базовом растворе составляла 1 мМ. Трансмембранные токи нейронов регистрировали методом “patch-clamp” в конфигурации целой клетки с использование усилителя Multiclamp 700B (Molecular Devices, США) с включенным фильтром нижних частот 400 Гц и оцифровкой со скоростью сбора данных 20 тысяч измерений в секунду с использованием АЦП Digidata 1440A (Molecular Devices, США) и программного обеспечения pClamp v10.6 (Molecular Devices). Замену раствора осуществляли с помощью быстрой перфузионной системы, как описано ранее [4]. Внутриклеточный пипеточный раствор содержал (в мМ): 120 CsF, 10 CsCl, 10 EGTA и 10 HEPES, осмолярность 300 мОсм, pH доводили до 7.4 с помощью CsOH. Пипетки с сопротивлением 4–6 МОм изготавливали из капилляров из боросиликатного стекла RWD B-15086-10F (Китай). Эксперименты проводили при комнатной температуре (22–25 ◦С). Мембранный потенциал фиксации устанавливали на ‒70 мВ. Данные представлены без поправок на величину жидкостного потенциала, который в наших экспериментах составлял ‒11 мВ. Токи NMDA-рецепторов вызывали аппликацией 100 мкМ NMDA совместно с 30 мкМ глицина в качестве ко-агониста. Вещества NMDA (M3262), глицин (G7126) и дитиотреитол, DTT (D0632) приобретены в Sigma-Aldrich, США. GNE-9278 (кат. 6369) в Tocris Inc., США.

Для определения эффективной концентрации наружного кальция (EC50[Ca2+]), необходимой для развития процесса десенситизации NMDA-рецепторов, измеряли соотношения равновесных токов рецептора (Iss) к пиковым значениям (Iss / Ipeak) при различных концентрациях внеклеточного кальция ([Ca2+]). Полученные данные аппроксимировали уравнением Хилла: Iss / Ipeak = 1 + (m – 1) * [Ca2+]h / (EC50h + [Ca2+]h), где h – коэффициент Хилла, m – минимальная величина соотношения плато/пик.

Для подбора кинетических констант скоростей активации, деактивации, а также входа и выхода рецептора из десенситизации использовали макроскопический анализ токов в программе ChanneLab (Synaptosoft). В качестве базовой модели использовали набор констант, опубликованный для нативных NMDA-рецепторов, постоянно связанных с глицином [30]. Симуляцию токов на основании полученных констант выполняли в той же программе.

Данные показаны как репрезентативные записи и средние значения ± стандартная ошибка среднего, (n) относится к количеству исследованных нейронов. Пары данных сравнивались с использованием непарного двустороннего t-критерия Стьюдента. Несколько групп сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим применением критерия Тьюки. Статистическая значимость представлена на рисунках в соответствии со следующими символами * и ***, которые обозначают значения доверительной вероятности p менее 0.05 и 0.001, соответственно. Кроме того, указаны значения p для каждого сравнения. Аппроксимацию кривой проводили с использованием программного обеспечения OriginPro (OriginLab Corp.). Значения EC50, полученные в результате отдельных экспериментов, проведенных в одних и тех же экспериментальных условиях, усредняли для получения средних значений ± стандартная ошибка.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изменение соотношения равновесного тока к пиковому при действии ПАМ

Для проверки предположения, что ПАМ могут влиять на процесс КЗД NMDA-рецепторов, на каждом исследованном нейроне мы анализировали форму токового ответа нейронов на аппликацию 100 мкМ NMDA (+30 мкМ глицина) (рис. 1a) в контроле, а затем на фоне действия одного из трех ПАМ. Опыты проводили в присутствии 1 мМ внеклеточного кальция. GNE-9278 (10 мкМ) и CuSO4 (5 мкМ) апплицировали совместно с NMDA. Использованная концентрация ионов меди соответствовала максимальному потенцирующему эффекту на NMDA-рецепторы, поскольку более высокие концентрации могут напротив вызывать ингибирование [18]. DTT (1 мМ) добавляли во внеклеточный раствор на 90 сек, отмывали 30 сек внеклеточным раствором, после чего апплицировали NMDA. Такой протокол воздействия DTT был разработан ранее [16] и позволяет модифицировать только наиболее доступные дисульфидные связи во внеклеточном домене рецептора, к которым относится связь C744–798, разрыв которой и вызывает потенцирующий эффект [31].

 

Рис. 1. Влияние положительных аллостерических модуляторов на степень кальций-зависимой десенситизации NMDA-рецепторов

(a) – Примеры токов NMDA-рецепторов, зарегистрированных в конфигурации целой клетки на нейронах при аппликации 100 мкМ NMDA в присутствии 30 мкМ глицина. Vm= – 70 мВ при постоянной концентрации внеклеточного кальция 1 мМ. Черные кривые – токи в контроле. Красные кривые – на фоне действия дитиотреитола (DTT, 1 мМ), CuSO4 (Cu, 5 мкМ) или GNE-9278 (GNE, 10 мкМ). Степень десенситизации оценивали по отношению амплитуд равновесного тока к пиковому (Iss / Ipeak). (b) – Средние значения отношения Iss / Ipeak в контроле (белые столбики) и на фоне действия аллостерических модуляторов (красные столбики). Кружки показывают результаты измерений в отдельных нейронах: DTT (n = 14), Cu (n = 12), GNE (n = 8). *** – отличие от контроля в присутствии GNE, p = 0.0002, парный t-критерий Стьюдента

 

Соотношение амплитуд равновесного тока к пиковому (Iss / Ipeak) не изменялось на фоне действия DTT или ионов меди (рис. 1b). Однако добавление 10 мкМ GNE-9278 увеличивало это соотношение с 0.62 ± 0.06 в контроле до 0.77 ± 0.05 на фоне GNE-9278. Таким образом, в отличие от DTT и ионов меди, действующих на редокс сайты во внеклеточном домене рецептора, GNE-9278, связывающийся с трансмембранным доменом, ослаблял кальций-зависимую десенситизацию NMDA-рецепторов.

Возрастание интегрального тока через NMDA-рецепторы на фоне действия ПАМ гипотетически могло бы влиять на выраженность КЗД за счет изменившегося входа кальция. В связи с этим, изучали возможную связь между эффективностью потенциирования пикового тока изучаемыми ПАМ и их влиянием на КЗД (рис. 2). Все три ПАМ ожидаемо достоверно увеличивали величину пикового тока в среднем на 16% для GNE-9278 и ионов меди (рис. 2a, b), и на 32% для DTT (рис. 2b). Поскольку при одинаковой выраженность потенциирования пикового ответа ионами меди и GNE-9278 только последний вызывал ослабление кальций-зависимой десенситизации, можно предположить, что эффективность потенциирования не связана с влиянием на КЗД. Кроме того, изменение концентрации внеклеточного кальция также не влияло на возрастание пиковой амплитуды токов при действии ПАМ.

 

Рис. 2. Эффект положительных аллостерических модуляторов на пиковый ток, вызываемый аппликацией 100 мкМ NMDA в присутствии 30 мкМ глицина при различных экспериментальных условиях

(a) – Отношение пикового в присутствии 5 мкМ CuSO4 (Cu) к пиковому току в контроле. (b) – Отношение пикового тока в присутствии 10 мкМ GNE-9278 (GNE) к пиковому току в контроле. (c) – Отношение пикового тока после 90 сек обработки 1 мМ дитиотреитолом (DTT) к пиковому току в контроле. Кружки показывают результаты измерений в отдельных нейронах. Во всех экспериментальных условиях наблюдали достоверное увеличение амплитуды пикового тока относительно контрольного на фоне модуляторов (p < 0.05, парный t-критерий Стьюдента). Потенциирование тока достоверно не изменяется в зависимости от типа использованного ПАМ, а также от концентрации внеклеточного кальция (ANOVA)

 

Зависимость эффектов GNE-9278 от внеклеточного кальция

Эффективная концентрация внеклеточного кальция, необходимая для проявления КЗД NMDA-рецепторов (EC50[Ca2+]), зависит от входа Ca2+ через рецептор, его буферизации, связывания с кальмодулином (Cam) и взаимодействия CaCam с внутриклеточным доменом рецептора. Мы предположили, что GNE-9278 мог бы влиять на процесс взаимодействия рецептора с CaCam. В этом случает величина EC50[Ca2+] изменялась бы под действием GNE-9278.

Для определения EC50[Ca2+] в контроле и в присутствии 10 мкМ GNE-9278 нами были построены концентрационные кривые зависимости соотношения Iss / Ipeak от концентрации внеклеточного кальция в диапазоне от 0.5 до 4 мМ [Ca2+] (рис. 3a). В случае, если GNE-9278 влияет на десенситизацию путем изменения EC50[Ca2+] наблюдался бы сдвиг кривой вправо в сторону больших [Ca2+] в присутствии GNE-9278. Однако, EC50[Ca2+] в контроле (1.79 ± 0.20 мМ) достоверно не возрастала в присутствии GNE-9278 (1.7 ± 0.2 мМ). Таким образом, действие GNE-9278 вероятно связано только с изменением кинетики десенситизации самого рецептора, но не с его взаимодействием с CaCam.

 

Рис. 3. Количественная зависимость влияния GNE-9278 на выраженность кальций-зависимой десенситизации NMDA-рецепторов от концентрации внеклеточного кальция

(a) – Зависимость соотношения плато/пик (Iss / Ipeak) от концентрации внеклеточного кальция. Кружки показывают средние значения по результатам 8–14 опытов. Аппроксимация при помощи уравнения Хилла (кривые) позволила определить эффективные концентрации кальция (EC50), необходимые для развития кальций-зависимой десенситизации в контроле (черный) и на фоне 10 мкМ GNE-9278. (b) – Постоянная времени спада тока от пика к равновесному состоянию при различных концентрациях внеклеточного кальция. Серые столбцы – контроль. Красные – на фоне 10 мкМ GNE-9278. Кружки показывают результаты измерений в отдельных нейронах. * – достоверные отличия от контроля, p < 0.05, парный t-критерий Стьюдента

 

Влияние GNE-9278 на постоянную времени КЗД

Оценка кинетики развития процесса кальций-зависимой десенситизации NMDA-рецепторов возможна путем одноэкспоненциальной аппроксимации спада тока от пика к плато. Мы измерили постоянную времени (τ) спада тока в контроле и на фоне действия GNE-9278 при различных концентрациях внеклеточного кальция (рис 3b). В диапазоне концентраций Ca2+ от 0.5 до 2 мМ GNE-9278 вызывал достоверное увеличение τ приблизительно вдвое, что говорит о 2-кратном замедлении процесса десенситизации.

Таким образом, в отличие от DTT и ионов меди, GNE-9278 ослабляет кальций-зависимую десенситизацию NMDA-рецепторов, что проявляется в уменьшении разницы между пиковым и равновесным током и замедлении КЗД, но не за счет влияния на эффективную концентрацию кальция, необходимую для развития десенситизации.

Моделирование токовых ответов NMDA-рецепторов

Наблюдаемые изменения в кинетике интегрального тока, опосредуемого активацией NMDA-рецепторов, при действии GNE-9278 могут быть проанализированы с использованием простой кинетической модели, которая описывает набор последовательных состояний рецептора от связывания лиганда до открытого состояния через константы скорости перехода между этими состояниями [25] (рис. 4a). Такая модель позволяет выполнить симуляцию интегральной формы тока через каналы множества рецепторов в ответ на аппликацию агониста. При симуляции мы подразумеваем, что оба коагониста – NMDA и глицин используются в насыщающих концентрациях, причем глицин постоянно присутствует в растворе. В таких условиях, даже если ПАМ вызывает снижение константы связывания агониста, это не скажется на амплитуде и форме токов.

 

Рис. 4. Анализ возможного механизма действия GNE-9278 в рамках кинетической модели NMDA-рецептора

(a) – Математическая модель [25] использованная для симуляции и описывающая скорости перехода NMDA-рецептора между состояниями: R + A — рецептор не связанный с агонистом, RA — связывание первой молекулы NMDA, RAA — связывание двух молекул NMDA, RAA* — лигандирванный рецептор с открытым ионным каналом, RAAD — десенситизированный рецептор, ассоциированный с комплексом Ca2+-кальмодулин (CaCaM). a, b, c и d – прямые (+) и обратные (‒) скорости переходов между состояниями в с-1 (величины приведены в таблице 1). В модели подразумевается постоянное оккупирование GluN1 субъединицы глицином, поэтому связывание рецептора с глицином не показано. (b) – Симуляция формы токовых ответов NMDA-рецепторов на 7-секундные аппликации NMDA с параметрами, наиболее соответствующими экспериментальным значениям при концентрации внеклеточного Ca2+ 1 мМ (таблица 1). Черные кривые — Симуляция тока в контроле. Константы d+ и d‒ изменены, по сравнению с опубликованной моделью чтобы соответствовать нашим экспериментальным данным. Снижение скорости деактивации рецептора (с‒) вызывает рост амплитуды тока и изменение соотношения плато-пик — красная кривая. Изменение с‒ не влияет на постоянную времени КЗД. Одновременное уменьшение скоростей входа (d+) и выхода (d‒) рецептора из десенситизации влияет исключительно на постоянную времени десенситизации — зеленая кривая. Синяя кривая — Симуляция тока в присутствии GNE-9278. Сумма обоих эффектов изменения с‒, d+ и d‒ позволяет воспроизвести форму токового ответа, полученного в экспериментах при действии GNE-9278

 

В принципе, увеличение токов ионотропных рецепторов может определяться только тремя причинами: увеличением их проводимости, увеличением времени открытого состояния и увеличением вероятности открытого состояния. Последнее может регулироваться за счет изменения КЗД. Наблюдаемые изменения токов NMDA-рецепторов при действии GNE-9278 характеризуются тремя параметрами — соотношением равновесного тока к пиковому (Iss / Ipeak), возрастанием амплитуды пикового тока (I / Icontrol) и постоянной времени спада (таблица 1). Для экспериментально полученных данных о форме тока в контроле достаточно подобрать значения констант d+ и d‒, определяющих скорости входа в десенситизацию и выхода рецептора из десенситизированного состояния (таблица 1). Значения остальных констант (a+, a-, b+, b-, c+, c-) были взяты из опубликованной ранее модели [30].

 

Таблица 1. Кинетические параметры токов NMDA-рецепторов

 

Экспериментальные значения

Результат подбора параметров (с-1)

r

Пиковый ток

τ

Iss / Ipeak

I / Icontrol

мс

a+

a‒

b+

b‒

c+

c‒

d+

d‒

Контроль

0.62

1

616

1·107

4.7

5·106

9.4

46.5

91

1.35

1.35

GNE-9278

0.78

1.16

1267

1·107

4.7

5·106

9.4

46.5

72

0.65

0.65

Экспериментальные значения включают выраженность десенситизации (r), амплитуду пикового тока, нормализованную к контролю и постоянную времени десенситизации (τ).

 

Мы предположили, что наблюдаемые эффекты GNE-9278 связаны с влиянием на прямые и/или обратные константы скорости активации рецептора (c+, c‒), что может соответствовать изменению времени открытого состояния, и входа в десенситизированное состояние (d+, d‒), что может приводить к изменению вероятности открытого состояния. Т.е., неактивный рецептор, связанный с агонистами (RAA), может перейти либо в активированное состояние (RAA*) с открытым ионным каналом, либо в десенситизированное (RAAD) с закрытым каналом (рис. 4a).

Наблюдаемое в эксперименте увеличение амплитуды пикового тока и изменение соотношения плато-пик в присутствии GNE-9278 (таблица 1) можно смоделировать, если уменьшить скорость закрывание канала (c‒) (рис 4b, красная кривая). Подобная симуляция не оказывает влияние на постоянную времени КЗД. Одновременное уменьшение на половину констант скорости входа в десенситизацию и выхода из десенситизированного состояния (d+ и d‒) объясняет 2-кратное замедление КЗД в присутствии GNE-9278 (рис 4b, зеленая линия), но не влияет на соотношение плато-пик. Сумма этих двух эффектов позволяет воспроизвести форму экспериментально полученного тока в присутствии GNE-9278 (рис 4b, синяя линия). Таким образом, GNE-9278 вероятно одновременно замедляет переход рецептора в десенситизированное состояние и выход из него, а также снижает вероятность его деактивации т.е. закрывания канала.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Поскольку ПАМ вызывают увеличение амплитуды токов, вызываемых NMDA, мы можем ожидать связанный с этим рост входа кальция в нейроны, что, потенциально может оказать влияние на выраженность КЗД. В случае значительной разницы в эффективности ПАМ в отношении потенцирования токов эти вещества теоретически могли бы влиять на КЗД по-разному. Пиковый ток в ответ на аппликацию агониста не подвержен действию КЗД, и может быть использован для измерения эффективности потенциирования тока различными ПАМ. Поэтому мы сравнили степень увеличения пикового тока ионами меди, DTT и GNE-9278, чтобы выявить связан ли эффект этих ПАМ на КЗД со степенью потенциирования токов. Ионы меди и GNE-9278 вызывали одинаковое 16% увеличение амплитуды пиковых токов. Однако эти два ПАМ по-разному влияли на соотношение плато-пик. По-видимому, увеличение амплитуды токов не связано с особенностями действия GNE-9278 на КЗД.

Кроме того, эффективная концентрация внеклеточного кальция, необходимая для возникновения десенситизации NMDA-рецепторов, не изменялась в присутствии GNE-9278. Вероятнее всего эффект GNE-9278 на КЗД ограничен влиянием на сам рецептор и не затрагивает кинетику взаимодействия рецептора с CaCam.

Анализ изменения формы токов, активируемых NMDA, показал, что GNE-9278 изменяет два кинетических параметра: снижает скорость закрывания канала (c‒), что согласуется с предположениями других авторов [25], а также замедляет процессы входа в десенситихацию и выхода рецептора из десенситизированного состояния (d+, d‒). Последнее вероятно связано с уникальным сайтом связывания GNE-9278 во внеклеточной части трансмембранного домена в области pre-M1 GluN1 субъединицы [25], изменения конформации которой происходит в процессе КЗД [26]. Этот сайт не перекрывается с областью связывания нейростероидов [32] и лишь частично совпадает с таковой для CIQ, который потенциирует токи GluN2C и GluN2D содержащих NMDA-рецепторов [33]. Однако, токи GluN2C и GluN2D содержащих рецепторов не подвержены КЗД, поэтому эффект CIQ на этот процесс выявить не удалось. В отличие от CIQ, GNE-9278 менее селективен в отношении GluN2 субъединицы NMDA-рецепторов и может влиять на токи GluN2A и GluN2B содержащих рецепторов, обладающих выраженной КЗД.

Возможность существования низкомолекулярных соединений, влияющих на КЗД NMDA-рецепторов, является интересным с точки зрения поиска безопасных фармакологических препаратов для компенсации дефицита функций NMDA-рецепторов на фоне деменций и некоторых других неврологических нейродегенеративных заболеваний. Снижение КЗД NMDA-рецепторов увеличивает интегральный вход кальция при синаптической передаче. Это теоретически может увеличивать эффективность формирования феномена долговременной потенциации, связанного с процессами обучения и памяти. В связи с этим нам представляется перспективным дальнейшем изучение этого вопроса.

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Идея работы и планирование эксперимента (Д.А.С.), сбор данных (А.И.Ф.), обработка данных (А.И.Ф., Д.А.С.), написание и редактирование манускрипта (Д.А.С., С.М.А.).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при поддержке госзадания ИЭФБ РАН 075-00264-24-00.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все процедуры с использованием животных проводились в соответствии с рекомендациями Федерации ассоциаций по изучению лабораторных животных (FELASA) и одобрены Комитетами по содержанию и использованию животных Института имени И.М. Сеченова (Протокол 1-6/2022 заседания Комитета по биоэтике от 27 января 2022 г.).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.

×

Об авторах

А. И. Федорина

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Email: dsibarov@gmail.com
Россия, Санкт-Петербург

С. М. Антонов

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Email: dsibarov@gmail.com
Россия, Санкт-Петербург

Д. А. Сибаров

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: dsibarov@gmail.com
Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Hansen KB, Wollmuth LP, Bowie D, Furukawa H, Menniti FS, Sobolevsky AI, Swanson GT, Swanger SA, Greger IH, Nakagawa T, McBain CJ, Jayaraman V, Low CM, Dell'Acqua ML, Diamond JS, Camp CR, Perszyk RE, Yuan H, Traynelis SF (2015) Structure, function, and pharmacology of glutamate receptor ion channels. Pharmacol Rev 73(4): 298–487. https://doi.org/10.1124/pharmrev.120.000131
  2. Ehlers MD, Zhang S, Bernhadt JP, Huganir RL (1996) Inactivation of NMDA receptors by direct interaction of calmodulin with the NR1 subunit. Cell 84: 745–755. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)81052-1
  3. Sibarov DA, Antonov SM (2018) Calcium-dependent desensitization of NMDA receptors. Biochemistry (Moscow) 83(10): 1173–1183. https://doi.org/10.1134/S0006297918100036
  4. Sibarov DA, Abushik PA, Poguzhelskaya EE, Bolshakov KV, Antonov SM (2015) Inhibition of plasma membrane Na/Ca-exchanger by KB-R7943 or lithium reveals its role in Ca-dependent N-methyl-D-aspartate receptor inactivation. J Pharmacol Exp Ther 355(3): 484–495. https://doi.org/10.1124/jpet.115.227173
  5. Boikov SI, Karelina TV, Sibarov DA, Antonov SM (2024) Selective inhibitor of sodium-calcium exchanger, SEA0400, affects NMDA receptor currents and abolishes their calcium-dependent block by tricyclic antidepressants. Front Pharmacol 15:1432718. https://doi.org/10.3389/fphar.2024.1432718
  6. Rycroft BK, Gibb AJ (2004) Regulation of single NMDA receptor channel activity by alpha-actinin and calmodulin in rat hippocampal granule cells. J Physiol 557(3): 795–808. https://doi.org/10.1113/jphysiol.2003.059212
  7. Zhang S, Ehlers MD, Bernhardt JP, Su CT, Huganir RL (1998) Calmodulin mediates calcium-dependent inactivation of N-methyl-D-aspartate receptors. Neuron 21(2): 443–453.
  8. Krupp JJ, Vissel B, Heinemann SF, Westbrook GL (1996) Calcium-dependent inactivation of recombinant N-methyl-D-aspartate receptors is NR2 subunit specific. Mol Pharmacol 50(6): 1680–1688.
  9. Hill MD, Blanco M, Salituro FG, Bai Z, Beckley JT, Ackley MA, Dai J, Doherty JJ, Harrison BL, Hoffmann EC, Kazdoba TM, Lanzetta D, Lewis M, Quirk MC, Robichaud AJ (2022) SAGE-718: A first-in-class N-methyl-D-aspartate receptor positive allosteric modulator for the potential treatment of cognitive impairment. J Med Chem 65(13): 9063–9075. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c00313
  10. Rock DM, Macdonald RL (1995) Polyamine regulation of N-methyl-D-aspartate receptor channels. Annu Rev Pharmacol Toxicol 35: 463–482. https://doi.org/10.1146/annurev.pa.35.040195.002335
  11. Skatchkov SN, Antonov SM, Eaton MJ (2016) Glia and glial polyamines. Role in brain function in health and disease. Biochem (Mosc) Suppl Ser A Membr Cell Biol 10: 73–98. https://doi.org/10.1134/S1990747816010116
  12. Bowlby MR (1993) Pregnenolone sulfate potentiation of N-methyl-D-aspartate receptor channels in hippocampal neurons. Mol Pharmacol 43: 813e819.
  13. Paul SM, Doherty JJ, Robichaud AJ, Belfort GM, Chow BY, Hammond RS, Crawford DC, Linsenbardt AJ, Shu HJ, Izumi Y, Mennerick SJ (2013) The major brain cholesterol metabolite 24(S)-hydroxycholesterol is a potent allosteric modulator of N-methyl-D-aspartate receptors. J Neurosci 33: 17290−17300. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2619-13.2013
  14. Skeberdis VA, Chevaleyre V, Lau CG, Goldberg JH, Pettit DL, Suadicani SO, Lin Y, Bennett MV, Yuste R, Castillo PE, Zukin RS (2006) Protein kinase A regulates calcium permeability of NMDA receptors. Nat Neurosci 9(4): 501–510. https://doi.org/10.1038/nn1664
  15. Jackson MF, Konarski JZ, Weerapura M, Czerwinski W, MacDonald JF (2006) Protein kinase C enhances glycine-insensitive desensitization of NMDA receptors independently of previously identified protein kinase C sites. J Neurochem 96(6): 1509–1518. https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.2006.03651.x
  16. Köhr G, Eckardt S, Lüddens H, Monyer H, Seeburg PH (1994) NMDA receptor channels: Subunit-specific potentiation by reducing agents. Neuron 12: 1031–1040. https://doi.org/10.1016/0896-6273(94)90311-5
  17. Abe K, Kimura H (1996) The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous neuromodulator. J Neurosci 16: 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996
  18. Marchetti C, Baranowska-Bosiacka I, Gavazzo P (2014) Multiple effects of copper on NMDA receptor currents. Brain Res 1542: 20–31. https://doi.org/10.1016/j.brainres.2013.10.029
  19. Sibarov DA, Boikov SI, Karelina TV, Antonov SM (2020) GluN2 Subunit-dependent redox modulation of NMDA receptor activation by homocysteine. Biomolecules 10: 1441. https://doi.org/10.3390/biom10101441
  20. Zhang XL, Li YX, Berglund N, Burgdorf JS, Donello JE, Moskal JR, Stanton PK (2024) Zelquistinel acts at an extracellular binding domain to modulate intracellular calcium inactivation of N-methyl-D-aspartate receptors. Neuropharmacology 6; 259:110100. https://doi.org/10.1016/j.neuropharm.2024.110100.
  21. Yakovlev AV, Kurmasheva E, Ishchenko Y, Giniatullin R, Sitdikova G (2017) Age-dependent, subunit specific action of hydrogen sulfide on GluN1/2A and GluN1/2B NMDA receptors. Front Cell Neurosci 11: 375. https://doi.org/10.3389/FNCEL.2017.00375
  22. Chen CQ, Xin H, Zhu YZ (2007) Hydrogen sulfide: third gaseous transmitter, but with great pharmacological potential. Acta Pharmacol Sin. 28(11): 1709–1716. https://doi.org/10.1111/j.1745-7254.2007.00629.x. PMID: 17959020.
  23. Varga V, Jenei Z, Janáky R, Saransaari P, Oja SS (1997) Glutathione is an endogenous ligand of rat brain N-methyl-D-aspartate (NMDA) and 2-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate (AMPA) receptors. Neurochem Res 22(9): 1165–1171. https://doi.org/10.1023/a:1027377605054. PMID: 9251108.
  24. Horak M, Vlcek K, Petrovic M, Chodounska H, Vyklicky LJr (2004) Molecular mechanism of pregnenolone sulfate action at NR1/NR2B receptors. J Neurosci 24(46): 10318–10325. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2099–04.2004
  25. Wang TM, Brown BM, Deng L, Sellers BD, Lupardus PJ, Wallweber HJA, Gustafson A, Wong E, Volgraf M, Schwarz JB, Hackos DH, Hanson JE (2017) A novel NMDA receptor positive allosteric modulator that acts via the transmembrane domain. Neuropharmacology, 121: 204–218. https://doi.org/10.1016/j.neuropharm.2017.04.041
  26. Bhatia NK, Carrillo E, Durham RJ, Berka V, Jayaraman V (2020) Allosteric changes in the NMDA receptor associated with calcium-dependent inactivation. Biophys J 119(11): 2349–2359. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2020.08.045.
  27. Monyer H, Burnashev N, Laurie DJ, Sakmann B, Seeburg PH (1994) Developmental and regional expression in the rat brain and functional properties of four NMDA receptors. Neuron 12: 529–540. https://doi.org/10.1016/ 0896-6273(94)90210-0
  28. Paoletti P, Bellone C, Zhou Q (2013) NMDA Receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nat Rev Neurosci 14: 383–400. https://doi.org/10.1038/nrn3504
  29. Mironova EV, Evstratova AA, Antonov SM (2007) A fluorescence vital assay for the recognition and quantification of excitotoxic cell death by necrosis and apoptosis using confocal microscopy on neurons in culture. J Neurosci Meth 163(1): 1–8. https://doi.org/10.1016/j.jneumeth.2007.02.010
  30. Lester RA, Jahr CE (1992) NMDA channel behavior depends on agonist affinity. J Neurosci 12(2): 635–643. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.12–02–00635.1992
  31. Sullivan JM, Traynelis SF, Chen HS, Escobar W, Heinemann SF, Lipton SA (1994) Identification of two cysteine residues that are required for redox modulation of the NMDA subtype of glutamate receptor. Neuron 13(4): 929-936. https://doi.org/10.1016/0896-6273(94)90258-5.
  32. Jang MK, Mierke DF, Russek SJ, Farb DH (2004) A steroid modulatory domain on NR2B controls N-methyl-D-aspartate receptor proton sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A 101(21): 8198–8203. https://doi.org/10.1073/pnas.0401838101
  33. Ogden KK, Traynelis SF (2013) Contribution of the M1 transmembrane helix and pre-M1 regionto positive allosteric modulation and gating of N-methyl-D-aspartate receptors. Mol pharmacol 83(5): 1045–1056. https://doi.org/10.1124/mol.113.085209

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Влияние положительных аллостерических модуляторов на степень кальций-зависимой десенситизации NMDA-рецепторов

Скачать (37KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Эффект положительных аллостерических модуляторов на пиковый ток, вызываемый аппликацией 100 мкМ NMDA в присутствии 30 мкМ глицина при различных экспериментальных условиях

Скачать (40KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Количественная зависимость влияния GNE-9278 на выраженность кальций-зависимой десенситизации NMDA-рецепторов от концентрации внеклеточного кальция

Скачать (35KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Анализ возможного механизма действия GNE-9278 в рамках кинетической модели NMDA-рецептора

Скачать (26KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».