Electrochemical immunosensors based on gold nanoparticles for the determination of ovalbumin in immunobiological preparations

Толық мәтін

Овальбумин (ОВА) – примесь целого ряда вакцинных препаратов, полученных с использованием эмбрионов куриных яиц и предназначенных для профилактики кори, краснухи, паротита, бешенства, желтой лихорадки и клещевого энцефалита, которая наиболее часто вызывает аллергические реакции [1]. Овальбумин содержится в некоторых препаратах, которые либо включены в национальный календарь прививок (например, вакцина “Гриппол”), либо являются жизненно необходимыми и часто используемыми в клинической практике лекарственными средствами (препараты интерферона) [2]. Допустимое остаточное количество ОВА в отечественной гриппозной вакцине составляет не более 100 нг/мл, однако этого количества достаточно, чтобы вызвать реакцию гиперчувствительности у лиц с аллергией к яичному белку [3]. Использование зарубежных тест-систем контроля содержания ОВА в иммунобиологических препаратах в настоящее время не разрешено в связи с тем, что они не зарегистрированы в РФ, а также из-за их высокой стоимости и недоступности.

В настоящее время для оценки качества вакцин в лабораториях контроля качества на фармацевтических предприятиях наиболее часто применяют твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) с ферментами в качестве маркеров протекания иммунной реакции. Наибольшей популярностью пользуются пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза. Несмотря на высокую чувствительность регистрации аналитических сигналов продуктов субстратных реакций с использованием данных ферментов, они обладают рядом недостатков: сложностью выделения и очистки фермента, лабильностью фермента в отношении ряда физико-химических и биологических факторов, значительной потерей активности фермента в процессе ковалентного связывания с иммуноглобулинами, влиянием на результаты анализа наличия в исследуемом образце ферментных ингибиторов. Эти недостатки обусловливают высокую стоимость, недостаточную стабильность иммуноферментных тест-систем для контроля качества вакцин и в основном связаны с биологическим характером маркера [4].

На сегодняшний день электрохимические иммуносенсоры с конъюгатами иммуноглобулинов, меченными НЧAu, широко используют для определения антигенов/антител в различных объектах, включая иммунобиологические препараты [5, 6].

В данной работе нами предложено использовать в качестве электрохимической маркерной метки НЧAu в твердофазном сэндвич-формате иммуносенсора для более экспрессного по сравнению с ИФА определения ОВА в некоторых иммунобиологических препаратах.

По сравнению с ферментами НЧAu обладают рядом преимуществ: высокой стабильностью, экономичностью, биосовместимостью с иммуноглобулинами при получении конъюгатов и возможностью регистрировать электрохимические сигналы с использование недорогого оборудования. Синтез НЧAu осуществляли по методу Френса [7]. Конъюгаты иммуноглобулинов кролика (IgG) против овальбумина с наночастицами золота (IgG@НЧAu) синтезировали методом пассивной адсорбции [8]. В качестве твердой субстратной подложки для иммобилизации рецепторного слоя захватывающих антител кролика против овальбумина использовали углеродную поверхность планарного печатного электрода, которая была модифицирована оксидом графена (ОГ). Для увеличения токопроводящих свойств рабочей поверхности электрода ОГ восстанавливали с помощью лазерного гравера. Белковые рецепторные слои электрохимического иммуносенсора оказывали пассивирующее действие на регистрацию чувствительного вольтамперометрического сигнала от НЧAu, в связи с этим в качестве проявителя НЧAu использовали смесь 0.5%-ного раствора нитрата серебра и смеси растворов восстановителей – 0.25%-ной лимонной кислоты и 0.2%-ного метола. Для определения OВА в некоторых иммунобиологических препаратах регистрировали чувствительный сигнал окисления серебра методом анодной инверсионной вольтамперометрии.

Новый электрохимический иммуносенсор позволил сократить время определения ОВА на 30 мин по сравнению с традиционными ИФА тест-системами в связи с отсутствием дополнительных стадий анализа, связанных с введением субстратов и стоп-реагентов.

Экспериментальная часть

Методика синтеза конъюгатов IgG@НЧAu. В основе метода Френса [7] лежит восстановление НЧAu из 0.01%-ного раствора золотохлористоводородной кислоты 1%-ным раствором цитрата натрия. Синтезировали НЧ Au со средним размером 17.3 ± 5.0 нм.

Для синтеза конъюгатов IgG@НЧAu методом пассивной адсорбции [8] использовали коммерческие иммуноглобулины класса G кролика против овальбумина (Имтек, Россия). Для подбора минимального количества иммуноглобулинов для стабилизации коллоидного раствора золота проводили титрование в лунках микротитровального планшета в присутствии 100 мкл 1 М раствора NaCl по методике [8]. В случае отсутствия изменения цвета лунки по сравнению с первоначальным винным количество иммуноглобулинов достаточно для защитного действия НЧ Au от коагулирующего действия NaCl. Масштабируя объемы растворов иммуноглобулинов кролика против овальбумина и раствора НЧAu, установили, что на 300 мкл раствора НЧAu необходимо 700 мкл раствора иммуноглобулинов с концентрацией 0.01 мг/мл. Приведенные фактические данные характеризуют защитную способность иммуноглобулинов в условиях эксперимента в отношении НЧAu со средним размером 17.3 ± 5.0 нм.

Конъюгат IgG@НЧAu очищали от несвязанных компонентов методом центрифугирования. Центрифужную пробирку объемом 3 мл наполняли 500 мкл 96% глицерина (Sigma, США) и 1 мл раствора полученного конъюгата. Центрифугирование осуществляли при скорости 25 000 об/мин и температуре +4 °C в течение 30 мин. Надосадочную жидкость отделяли, конъюгат с глицерином переносили в пробирку для хранения. Конъюгат хранили в морозильной камере при –10 °С в течение 1 года. Морфологию конъюгата IgG@НЧAu исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) с контрастированием белков 2.0%-ным раствором безводного уранил ацетата на просвечивающем электронном микроскопе Philips CM12 (FEI Electron Optics, Нидерланды) в Институте физики прочности и материаловедения CO PAH (Томск, Россия). Средние размеры неконъюгированных НЧ Au рассчитывали по изображениям ПЭМ с помощью программного обеспечения Fiji (www.fiji.sc) и Origin Pro 8.0 (OriginLab, США). Для каждого образца брали не менее десяти репрезентативных изображений. Распределение частиц по размерам получали путем подсчета по меньшей мере 100 частиц для каждого образца.

Изготовление электрохимического иммуносенсора. Электрохимический иммуносенсор представлял собой сэндвич-формат, где в качестве твердой подложки для иммобилизации иммуноглобулинов использовали углеродсодержащий планарный печатный электрод (OOO “Русенс”, Москва, Россия). Схема изготовления электрохимического иммуносенсора для определения овальбумина в вакцинах представлена на рис. 1.

 

Рис. 1. Схема электрохимического иммуносенсора для определения овальбумина в вакцинах.

 

На первой стадии разработки электрохимического иммуносенсора модифицировали углеродсодержащий планарный печатный электрод ОГ. Для того чтобы в модификации электрода не участвовали части электрода, выполняющие функцию электрода сравнения и вспомогательного электрода, поверхность предварительно закрывали трафаретом из двустороннего скотча. При этом поверхность рабочего электрода оставалась незакрытой. Далее 100 мкл суспензии ОГ (2 мг/мл) (Sigma, Германия) наносили на рабочую часть поверхности электрода и осторожно высушивали в течение 2 ч при 22 ± 2 °C. Для улучшения токопроводящих свойств поверхности электрода и увеличения электроактивной площади поверхности ОГ восстанавливали с помощью лазерного гравера мощностью 600 мВт при длине волны 405 нм [9, 10]. Инкубационный период для каждого шага иммобилизации биологического материала на поверхности восстановленного ОГ составлял 1 ч при 37 °С. После каждого этапа иммобилизации биологического материала трижды ополаскивали поверхность сенсора дистиллированной водой для удаления несвязанных компонентов. Для иммобилизации коммерческих иммуноглобулинов кролика против овальбумина использовали 100 мкл раствора с концентрацией 1 мкг/мл. Далее на поверхность сенсора наносили блок-реагент – 0.5%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА), по 100 мкл на каждый электрод. После этого на поверхности электрохимических сенсоров раскапывали по 100 мкл растворов овальбумина в концентрациях, соответствующих линейному диапазону от 0.5 до 24.0 нг/мл, или испытуемую вакцину в том же объеме. После иммобилизации овальбумина на поверхность каждого сенсора наносили по 100 мкл конъюгата IgG@НЧAu. Далее на поверхность сенсоров наносили по 100 мкл 0.5%-ного раствора AgNO₃ и 100 мкл раствора восстановителя – смеси 0.25%-ной лимонной кислоты и 0.2%-ного метола. Данная процедура позволила усилить сигнал золота серебром при его каталитическом восстановлении на поверхности НЧAu конъюгата IgG@НЧAu. Время восстановления серебра составило 3 мин. Далее на поверхность сенсора наносили 200 мкл фонового электролита и регистрировали сигнал серебра методом инверсионной вольтамперометрии. Для контроля специфичности разработанного электрохимического иммуносенсора в качестве отрицательных контрольных образцов использовали неспецифические к овальбумину IgG свиньи, иммобилизованные на поверхности иммуносенсора, а также БСА. В качестве метода сравнения для определения овальбумина в вакцинах использовали метод ИФА.

Регистрация электрохимического сигнала серебра иммуносенсора. Для регистрации электрохимического сигнала серебра использовали фоновый электролит состава 0.05 М HCl–0.05 М раствор NaClO₄ (1 : 1, по объему). Объем фонового электролита, который наносили в виде капли на рабочую поверхность иммуносенсора, составил 200 мкл. Условия регистрации электрохимического сигнала: анодная инверсионная вольтамперометрия, потенциал накопления –0.8 В, время накопления 60 с, диапазон потенциалов от –0.6 до +1.0 В со скоростью сканирования потенциала 100 мВ/с.

Результаты и их обсуждение

Синтезированные НЧAu и конъюгаты IgG@HЧAu для определения овальбумина в вакцинах характеризовали методами спектрофотомерией в видимой и УФ-областях и ПЭМ.

Спектры светопоглощения НЧAu и конъюгатов IgG@HЧAu регистрировали в диапазоне 300–700 нм (рис. 2). Максимум поглощения при 520 ± 2 нм обусловлен проявлением поверхностного плазмонного резонанса НЧAu, в то время как более широкий максимум поглощения при 550 нм, смещенный в более длинноволновую область по сравнению с пиком НЧAu, косвенно указывает на связывание НЧAu с IgG кролика против овальбумина.

 

Рис. 2. Спектры светопоглощения в видимой и УФ-областях в бидистиллированной воде (1) НЧAu (2) и конъюгатов IgG@НЧAu (3).

 

На рис. 3 представлены ПЭМ-изображения НЧAu и конъюгатов IgG@НЧAu. На рис. 3а видны НЧAu сферической формы со средним размером 17.3 ± 5.0 нм.

 

Рис. 3. Изображения, полученные методом просвечивающей электронной микроскопии, (а) НЧAu и (б) конъюгатов IgG@НЧAu (контрастирование IgG 2.0%-ным раствором уранил ацетата).

 

После синтеза и очистки конъюгатов IgG@НЧAu отмечено, что в их состав включены белковые компоненты иммуноглобулинов кролика (IgG) белого цвета c аморфной структурой, тогда как НЧAu сферической формы, распределенные на поверхности IgG, имеют темную окраску (рис. 3б). Изображение ПЭМ подтверждает успешность синтеза конъюгатов IgG@НЧAu.

После синтеза конъюгатов IgG@НЧAu регистрировали циклические вольтамперограммы от золотой метки до и после сборки электрохимического иммуносенсора (рис. 4а) в фоновом электролите состава HCl–0.1 М раствор NaCl. Согласно данным [6], в HCl можно растворить коллоидное золото конъюгата. Кроме того, хлорид-ионы позволяют окислить золото с образованием комплекса [AuCl₄]^-, который окисляется в диапазоне потенциалов от +1.0 до +1.2 В на электроде, изготовленном по типу трафаретной печати [6].

 

Рис. 4. Циклические вольтамперограммы (а) НЧAu конъюгатов IgG@НЧAu на углеродсодержащем планарном печатном электроде в 0.1 М растворе фонового электролита HCl–NaCl (1 : 1, по объему), v = 100 мВ/с, до иммобилизации рецепторного слоя (1), после иммобилизации рецепторного слоя (2); (б) циклические вольтамперограммы серебра после проявления на поверхности электрохимического иммуносенсора в разных фоновых электролитах: 1 – 0.05 М HCl–0.05 М раствор NaClO₄ (1 : 1), 2 – 0.25 М раствор KNO₃–0.5 М HNO₃ (1 : 1), объем фонового электролита – 200 мкл.

 

На рис. 4а показано, что после иммобилизации рецепторного слоя на поверхность сенсора сигнал от золотой метки конъюгатов не обнаружен, в отличие от поверхности без рецепторного слоя. Слои иммуноглобулинов и овальбумина экранируют электродную поверхность, что не позволяет зарегистрировать сигнал от золотой метки конъюгатов IgG@НЧAu в указанных электрохимических условиях. В связи с этим было решено усилить электрохимический сигнал золота серебром. Известно, что на поверхности НЧAu конъюгатов IgG@НЧAu можно каталитически восстановить другой металл, например Ag, Hg, Cu как электрохимическим, так и химическим способами [11–15]. Апробировали несколько потенциальных химических восстановителей серебра – п-фенилендиамин, гидрохинон, борогидрид натрия, метол и лимонную кислоту – на поверхности НЧAu конъюгатов IgG@НЧAu для усиления вольтамперометрического сигнала. Наилучшие результаты по регистрации чувствительного вольтамперометрического сигнала серебра для определения овальбумина в вакцинах достигнуты при использовании раствора восстановителя состава 0.2%-ная лимонная кислота и 0.25%-ный метол.

С целью выбора лучшего фонового электролита для регистрации вольтамперометрического сигнала серебра использовали два типа фоновых электролитов: смесь 0.25 М раствора KNO₃ и 0.5 М HNO₃ (1 : 1) и смесь 0.05 М HCl и 0.05 М раствора NaClO₄ (1 : 1). Для регистрации электрохимических сигналов серебра использовали метод циклической вольтамперометрии (ЦВА) со скоростью развертки 100 мВ/с в диапазоне потенциалов от –0.6 до +1 В. Электродные механизмы окисления-восстановления серебра в различных фоновых электролитах можно описать уравнениями (1), (2) для фонового электролита KNO₃–HNO₃ и (3), (4) для фонового электролита HCl–NaClO₄:

${\text{AG}}^{\text{+}}\text{+}\overline{е}\stackrel{\begin{array}{l}{\text{≈}}_{нак}\text{=\hspace{0.17em}-0.8 ¬}\\ {\text{T}}_{нак}\text{= 60 с}\end{array}}{\to }{\text{AG}}^{\text{0}}\text{,}$ (1)

$A{g}^0-\overline{e}\stackrel{{\text{≈ }}_{па}=+0.2\neg }{\to }A{g}^{+}(KN{O}_3/HN{O}_3),$ (2)

${\text{Ag}}^{\text{+}}{\text{+ -1}}^{-}\stackrel{\begin{array}{l}{\text{≈}}_{нак}\text{=\hspace{0.33em}}-\text{0.8 ¬}\\ t_{нак}\text{= 60 с}\end{array}}{\to }\text{Ag-1\hspace{0.17em}}\downarrow$, (3)

$AgCl+\overline{e}\stackrel{{\approx }_{ïà}=+0.1\text{ ¬}}{\to }A{g}^0+C{l}^{-}(HCl/NaCl{O}_4).$ (4)

На рис. 4б интенсивность редокс-сигналов AgCl в фоновом электролите 0.05 М HCl–0.05 М NaClO₄ в пять раз интенсивнее редокс-сигналов Ag в азотнокислом фоновом электролите 0.25 М раствор KNO₃–0.5 М HNO₃. Это свидетельствует о том, что хлорид серебра накапливается лучше на поверхностях НЧAu коньюгатов по сравнению с Ag⁰ при измерении аналитических сигналов методом ЦВА. В фоновом электролите 0.05 М HCl–0.05 М раствор NaClO₄ можно использовать как катодный, так и анодный ток в качестве аналитического сигнала. В дальнейших исследованиях применяли метод анодной инверсионной вольтамперометрии, а в качестве фонового электролита – 0.05 М HCl–0.05 М раствор NaClO₄ (1 : 1, по объему).

На рис. 5 представлено полученное методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) изображение поверхности иммуносенсора после каталитического восстановления серебра на НЧAu конъюгатов IgG@НЧAu смесью 0.2%-ной лимонной кислоты и 0.25%-ного метола, а также полученный методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (ЭДС) спектр поверхности иммуносенсора после каталитического восстановления серебра с характерными рентгеновскими линиями C, O, Au и Ag. На рис. 5а отчетливо видны крупные сферические образования на поверхности иммуносенсора после восстановления серебра. На ЭДС-спектре (рис. 5б) присутствуют характеристические рентгеновские линии С, О, Au и интенсивная линия Ag, что подтверждает наличие серебра на поверхности иммуносенсора после его каталитического восстановления.

 

Рис. 5. (а) Изображение поверхности иммуносенсора, полученное методом скагирующей электронной микроскопии, после каталитического восстановления серебра смесью 0.2%-ной лимонной кислоты и 0.25%-ного метола на НЧAu конъюгатов IgG@НЧAu (режим обратного рассеяния электронов поверхности); (б) спектр ЭДС поверхности иммуносенсора после каталитического восстановления серебра с характерными рентгеновскими линиями C, O, Au и Ag.

 

Для построения градуировочной зависимости интенсивности тока окисления AgCl от концентрации ОВА готовили серию градуировочных растворов ОВА с концентрациями от 0.125 до 24 нг/мл. На рис. 6 представлена градуировочная зависимость и вольтамперограммы окисления АgCl.

 

Рис. 6. Градуировочная зависимость для определения овальбумина с помощью электрохимического иммуносенсора в диапазоне концентраций от 0.125 до 128 нг/мл (вставка – анодные инверсионные вольтамперограммы окисления серебра).

 

Линейный диапазон, включающий концентрации от 0.5 до 24 нг/мл (lgI = lgc + 1.5, R² = = 0.999), находится в пределах допустимой нормы и ожидаемых концентраций ОВА в иммунобиологических препаратах [16] с учетом разведения проб. Предел обнаружения (ПО) ОВА, рассчитанный по 3s-критерию (ПО = 3s/b, где s – стандартное отклонение холостой пробы, b – наклон прямолинейного участка градуировочной прямой), составил 0.1 нг/мл [17].

Воспроизводимость работы иммуносенсора оценивали по значению относительного стандартного отклонения (s_r) в пределах одного эксперимента и между экспериментами, повторно исследуя стандартные растворы ОВА линейного диапазона на трех уровней концентрации (0.5, 8.0 и 24 нг/мл). Значение s_r в пределах одного эксперимента оценивали по 10 параллельным определениям, между разными эспериментами – по 6 определениям, выполненным в разные дни. Вариабельность в пределах одного эсперимента по определению концентраций ОВА в 10 повторах для каждого уровня концентраций не превышала 8% (s_r < 8%). Вариабельность между сериями определений, которую оценивали по измерениям в шести повторах для каждого уровня концентраций, составила менее 12% (s_r < 12%), что соответствует требованиям [16].

Правильность работы электрохимического иммуносенсора на ОВА оценивали методом введено–найдено и рассчитывали степень извлечения (%) на трех уровнях концентрации (0.5, 8.0 и 24 нг/мл). В качестве метода сравнения выбрали метод ИФА (табл. 1). Как видно из таблицы, значения степени извлечения находятся в диапазоне от 94 до 96% и укладываются в диапазон требований нормативной документации; компоненты матрицы не влияют на правильность полученных результатов определения ОВА предложенным электрохимическим иммуносенсором, которые согласуются с результатами ИФА.

 

Таблица 1. Результаты определения правильности и воспроизводимости овальбумина в модельных образцах на трех уровнях концентрации (n = 5, P = 0.95)

Введено ОВА, нг/мл	Найдено, c(ОВА) ± s, нг/мл	Степень извлечения, ٪	sr, %	sr (между сериями), ٪	Найдено ИФА, c(ОВА) ± s, нг/мл
0.50	0.47 ± 0.01	94	3.1	12	0.52 ± 0.02
8.0	7.7 ± 0.2	96	3.2	8	7.8 ± 0.3
24.0	23.0 ± 0.7	96	3.5	7	23.8 ± 1.0
Требуемая степень извлечения (%) для биоаналитических методик (ГФ XV), ICH		85–115
Критерий (ГФ XV) (ICH)				20.0

 

Для оценки селективности анализа изучали перекрестную реактивность ОВА с близкими по структуре антигенами. В качестве отрицательных контрольных образцов использовали бычий, человеческий и лошадиный альбумины, которые являются перекрестно реагирующими антигенами и могут вносить ложно положительные вклады в аналитические сигналы электрохимического иммуносенсора. Для каждого перекрестно реагирующего антигена рассчитывали процент перекрестной реактивности по формуле:

CR (%) = (IC_ОВА) / (IC_аналог) × 100 %, (5)

где CR – перекрестная реактивность, %; IC_ОВА – концентрация ОВА в середине градуировочной прямой; IC_аналог – концентрация перекрестно реагирующего соединения, которое на 50% ингибирует максимальный сигнал овальбумина [18].

Результаты определения перекрестной реактивности представлены в табл. 2. Из данных табл. 2 можно сделать вывод, что для исследуемого электрохимического иммуносенсора не выявлено выраженной перекрестной реакции ни с одним из анализируемых антигенов, что свидетельствует о его высокой селективности в отношении определения ОВА.

 

Таблица 2. Показатели селективности электрохимического иммуносенсора для определения овальбумина

Перекрестно-реагирующий антиген	СR, %
Бычий альбумин	0.82 ± 0.20
Человеческий альбумин	0.64 ± 0.20
Лошадиный альбумин	0.34 ± 0.09
Критерий [ГФ XV, (ICH)]	Не более 1%

 

В табл. 3 представлены сравнительные результаты определения ОВА в вакцинах с помощью электрохимического иммуносенсора и методом ИФА в иммунобиологических препаратах. Полученные результаты показали, что найденные с помощью разработанного электрохимического иммуносенсора концентрации ОВА соответствуют значениям, заявленным производителем, и согласуются с результатами традиционно используемого метода ИФА.

 

Таблица 3. Сравнительные результаты определения овальбумина в иммунологических препаратах с использованием разработанного электрохимического иммуносенсора и методом иммуноферментного анализа (n = 5, Р = 0.95)

Название препарата	Заявлено производителем, мкг/мл	Найдено электрохимическим методом, мкг/мл	Найдено ИФА, мкг/мл
Вакцина для профилактики гриппа Ваксигрип (SANOFI PASTEUR, S.A., Франция)	Не более 2.0	0.08 ± 0.02	0.09 ± 0.03
Вакцина для профилактики желтой лихорадки СинСаВак (ООО “Смартбиотех”, Россия)	Не более 2.0	1.1 ± 0.3	1.2 ± 0.4

 

***

Разработан электрохимический иммуносенсор на основе наночастиц золота для определения овальбумина, который отличается экономичностью и более высокой стабильностью конъюгатов по сравнению с ферментными тест-системами. Электрохимический иммуносенсор позволяет сократить продолжительность определения ОВА на 30 мин по сравнению с традиционными ИФА тест-системами, так как не требует дополнительных стадий введения субстратов и стоп-реагентов. Конъюгат и электрохимический иммуносенсор могут быть использованы в сэндвич-формате для высокочувствительного определения остатков овальбумина в некоторых иммунобиологических лекарственных препаратах с пределом обнаружения 0.1 нг/мл и диапазоном определяемых содержаний от 0.5 до 24 нг/мл. Значения степени извлечения при оценке правильности определения ОВА не превышали 94–96% и соответствовали требованиям нормативной документации. При исследовании селективности электрохимического иммуносенсора показана отрицательная перекрестная реактивность (CR < 1%) со структурно родственными овальбумину соединениями.

Финансирование работы

Исследования выполнены за счет субсидии из федерального бюджета на финансовое обеспечение выполнения госзадания, проект № FSWW-2023-0008. Исследование выполнено при поддержке программы развития Томского политехнического университета.

Конфликт интересов

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Авторлар туралы

Е. Dorozhko

National Research Tomsk Polytechnic University

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: evd@tpu.ru
Ресей, 634050, Tomsk, Lenin Avenue 30

A. Solomonenko

National Research Tomsk Polytechnic University

Email: evd@tpu.ru
Ресей, 634050, Tomsk, Lenin Avenue 30

M. Saqib

National Research Tomsk Polytechnic University

Email: evd@tpu.ru
Ресей, 634050, Tomsk, Lenin Avenue 30

V. Semin

Institute of Strength Physics and Materials Science, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: evd@tpu.ru
Ресей, 634055, Tomsk, Academic Avenue, 2/4

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар