Comparison of methods for rapid assessment of selectivity and efficiency of the analytical signal of fluorescent phases of different natures

Full Text

Наиболее перспективным и малоизученным подходом к разработке многокомпонентных, доступных и удобных в любых условиях тест-систем является применение в них в качестве реактивных центров флуоресцентных зондов. Такой способ хорошо подходит для различных биологических сред и основан на анализе изменений сигналов флуоресценции небольшим количеством молекул-зондов в биопробе малого объема [1−5]. Известно применение подобного подхода для ранней диагностики, но оно имеет ограниченное применение в животноводстве и в неинвазивных тест-средствах.

К потенциальным детектирующим зондам для различных малых биомолекул, в частности для легколетучих органических соединений (ЛОС), предъявляется ряд требований: они должны взаимодействовать с целевыми аналитами с высокими чувствительностью и специфичностью, быть относительно устойчивыми при хранении, давать устойчивый явный аналитический отклик, в составе простых тест-средств позволять быстро определять соединения-маркеры в небольшом объеме различных биологических образцов (например, мазков биосред) без дополнительной пробоподготовки. Существующие флуоресцентные или иные тест-системы для анализа биопроб либо весьма дорогостоящие, либо имеют недостаточно высокие чувствительность и селективность к биомаркерам [6−13].

Несомненным преимуществом применения флуоресцентных зондов внутри организма является возможность исследования с их помощью молекулярных механизмов возникновения и развития патологических процессов, действия на организм биологически активных веществ и лекарственных препаратов. Флуоресцентные зонды применяются также для диагностики и прогноза развития заболеваний, выявления факторов риска и контроля эффективности лечения [14−16]. Зондовая флуоресценция чувствительна к структурно-функциональным изменениям в биологических мембранах, микровязкости липидного бислоя, связыванию с белками и другими веществами, структурным перестройкам в белках, изменению мембранного потенциала и концентрации внутриклеточного кальция и др. [15]. Все эти факторы необходимо учитывать при изучении новых реагентов, которые потенциально могут быть применены в такого рода аналитических системах.

Особое место среди соединений с ярко выраженной и стабильной люминесценцией (в том числе по отношению к различным биомолекулам) занимают неорганические квантовые точки разной структуры и органические производные азолотриазинов. Однако лишь незначительное число публикаций посвящено синтезу линеарно связанных и конденсированных гетероциклических соединений, содержащих данный фрагмент. Между тем именно сочетание в одной молекуле нескольких гетероциклических фрагментов зачастую позволяет добиться более “чистой” люминесценции за счет синергетического действия и лучшего связывания с медиаторами воспалений и другими биомишенями [17−19].

В настоящий момент известно, что производные азолотриазинов характеризуются интенсивной люминесценцией. В частности, азотсодержащие гетероциклические люминофоры являются предметом изучения органической электроники, биохимии, биофизики и микробиологии. На их основе создаются электролюминесцентные датчики, лазеры и иные полупроводниковые приборы, иммунологические люминесцентные (флуоресцентные) зонды [17−24]. При анализе биологических систем отмечено их специфическое взаимодействие с различными микроорганизмами, грибами, биомолекулами, приводящее к видимым изменениям цвета люминесценции. Однако следует отметить, что органические люминесцирующие соединения, в частности азолотриазины, имеют проблему фотоустойчивости в возбуждающем излучении (быстрое выгорание), а корреляция между химической структурой и эффективностью флуоресценции еще далека от удовлетворительного понимания. Схожесть в изменении спектров люминесценции не всегда дает возможность определить конкретный биомаркер без дополнительных исследований. Квантовые точки (КТ), в свою очередь, имеют более высокий выход флуоресценции, но изменять их сродство к ЛОС на стадии синтеза или при дальнейшей обработке весьма сложно.

До настоящего времени актуальными остаются проблемы, связанные с разработкой новых методов и реакций, позволяющих осуществлять направленный синтез КТ, гетероциклических систем, содержащих остов азолотриазинов, в том числе структурно близких природным. Большое значение имеют также установление взаимосвязи между строением и люминесценцией, изучение и быстрая оценка перспективности новых реагентов для дальнейшего применения в аналитических тест-системах. Быстрый синтез и вариабельность свойств флуоресцентных фаз, как органических, так и неорганических, ставят задачу по оптимизации предварительного этапа оценки их оптических и реакционных свойств по отношению к конкретным аналитам. Применение дорогостоящего спектрального оборудования на этом этапе неэффективно и экономически неоправданно. Однако и упрощение до простых, в том числе визуальных, методов оценки аналитического отклика не всегда информативно на стадии определения вектора синтеза реагентов, когда их характеристики могут быть еще далеки от ожидаемых. На всех этапах поиска приоритетным является решение задач ускорения и упрощения стадий получения оценочной информации, при этом с сохранением условий, близких к условиям дальнейшего применения аналитических тест-систем. Для синтеза флуоресцентных реагентов наиболее доступными являются планшетные тесты с растворами аналитов. Однако реакции в растворах и в газовой среде с летучими соединениями могут не совпадать по вызываемому аналитическому эффекту. Тем более, что дальнейшее применение тест-систем на основе флуоресцентных зондов практически не изучено для газосодержащих сред. Обозначенные противоречия могут быть устранены путем применения метода, совмещающего в себе возможность использования малых концентраций твердотельных фаз реагентов и летучих паров ЛОС с возможностью экспрессного и несложного изучения, количественной оценки скорости, эффективности их взаимодействия.

Основной идеей предлагаемой работы является обоснование возможности предсказания эффективности реакций между фазами-реагентами и веществами-аналитами, протекающих в жидкой, газовой средах и приводящих к значительным изменениям в структуре люминофора, возникновению внешнего эффекта, регистрируемого не только спектральным методом, но и другими, например сорбционным, напрямую не регистрирующим изменение спектральных свойств в системе.

Цель работы – оценить возможность и надежность предсказания флуоресцентной активности органических (азолотриазины) и неорганических (на основе квантовых точек сульфида кадмия в хитозане) реагентов по отношению к приоритетным ЛОС, в том числе биомаркерам, по результатам исследований их спектральных и сорбционных свойств.

Для оценки влияния биомаркеров на возможное изменение оптических свойств новых реагентов выбраны следующие методы: визуальная флуориметрия с оцифровкой изображения при возбуждении при 365 и 254 нм фаз в растворах и на подложках после контакта с парами и растворами тест-веществ; фотолюминесценция при освещении лазером с длиной волны 405 нм фаз реагентов, нанесенных на бумажную подложку, при контакте их с парами тест-веществ на спектрометре; высокочувствительный прямой метод изучения сорбции паров – пьезокварцевое микровзвешивание микрофаз реагентов (сорбенты) при экспозиции в парах тест-веществ (сорбаты).

Экспериментальная часть

Характеристика реагентов. В качестве органических реагентов синтезировали соединения, содержащие остов имидазо- и пиразолотриазинов. В исследовании оценивали свойства следующих реагентов:

 

Наименование по IUPAC	Маркировка
2-(6-Оксо-2-фенилимидазо[1,2-b]пиридо[4,3-e][1, 2, 4]триазин-7(6Н)-ил)уксусная кислота	ФЗ 12
Этил-3-метил-6-фенилимидазо[1,2-b][1, 2, 4]триазин-2-карбоксилат	ФЗ 14
2-(4-Гидрокси-7-(метоксиметил)-8-фенилпиразоло[5,1-c][1, 2, 4]триазин-3-ил)бензойная кислота	ФЗ 28
2-(4-Гидрокси-8-фенилпиразоло[5,1-c][1, 2, 4]триазин-3-ил)бензойная кислота	ФЗ 32

 

Фазы хранили в виде растворов в неводных растворителях с концентрацией реагента 1 мг/мл.

Для оценки сорбционных свойств фазы наносили на электроды пьезокварцевых резонаторов (ПКР) и бумажные подложки.

В качестве неорганических реагентов изучали фазы на основе квантовых точек сульфида кадмия в хитозане без и с добавлением при синтезе родамина 6 G.

Синтез КТ основан на реакции

CdCl₂ + Na₂S = CdS + 2NaCl.

Для осуществления синтеза готовили исходные растворы хитозана с концентрацией 2 мас.% в 2%-ном растворе уксусной кислоты; 0.010 М растворы хлорида кадмия, сульфата натрия чистотой х. ч. Далее при постоянном перемешивании в раствор хитозана малыми порциями вводили растворы реагентов. Через 10−15 мин после непрерывного перемешивания коллоидный раствор приобретал характерный желтый цвет. На спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Центр коллективного пользования ФГБОУ ВО ВГУИТ) регистрировали спектры поглощения полученного раствора квантовых точек относительно раствора хитозана в диапазоне 250−900 нм. Ширина запрещенной зоны полученных КТ составляла для разных партий 2.6−2.8 эВ. Полученные КТ отмывали пропанолом-2, центрифугировали, наносили на серебряные электроды ПКР с двух сторон капельным методом. Также наносили методом капли на бумажную подложку фиксированный объем изопропанольного раствора КТ.

Для изменения сродства КТ к парам ЛОС дополнительно вводили в хитозан раствор родамина 6G с разным соотношением с КТ. Далее фазы также отмывали и наносили на ПКР и бумагу.

Кроме индивидуальных, применяли комбинированные фазы: на фазы КТ и наногидроксиапатита (ГА) в качестве нефлуоресцирующего наноматериала наносили капельным путем растворы органических люминофоров ГА/ФЗ 12 (ФЗ 28, ФЗ 32, ФЗ 14); СdS/ФЗ 32 (ФЗ 28, ФЗ 14, ФЗ 12). Массу фаз после удаления растворителей подбирали в диапазоне 3−8 мкг. Свободный растворитель удаляли в сушильном шкафу (20−40 мин при 50−60°C). Массу фаз контролировали по изменению базовой частоты колебания ПКР без нагрузки.

Тест-вещества. Оценивали сорбцию и спектральный отклик фаз по отношению к парам спиртов алифатических С₂–С₄ нормального и изомерного строения; метилэтилкетона, ацетона, аминов линейного и циклического строения (метиламин, диэтиламин, бутиламины, пиридин); этановой, пропановой кислот; этилацетата, ацетальдегида, раствора аммиака, воды, других тест-веществ. Применяли индивидуальные вещества в объеме 5−10 мкл для изучения сорбции паров при 20−22°С. Для оценки отклика растворов на планшете готовили водные растворы тест-веществ на двух уровнях концентрации: низкая соответствует норме процессов в организме человека; высокая – уровень диагностирования метаболических нарушений [25].

Характеристика приборов. Визуальная флуориметрия на планшетах с оцифровкой результатов взаимодействия фаз ФЗ и тест-веществ на денситометре “ДенСкан” (ООО "НЦ "Ленхром", С.-Петербург) при двух длинах волн возбуждения (365, 254 нм). Планшеты формировали по единой схеме добавления веществ с двукратным повторением.

 

ФЗ	H2O	М	М*	О	О*	В	В*	Н	Н*	К	К*
		Т	Т*	У	У*
		Г	Г*	З	З*	С	С*	Р	Р*	Д	Д*
		Ж	Ж*	П	П*	Б	Б*	И	И*

 

(буквами обозначены растворы тест-веществ: этаноламин (Г, Г*), бутиламин (М, М*), изобутиламин (Р, Р*), циклопентиламин (П, П*), триэтиламин (Н, Н*), морфолин (О, О*), пропионовая (В, В*), масляная (Т, Т*), молочная (У, У*), этановая (Ж, Ж*), 3-фенилмолочная (Д, Д*) кислоты; ацетон (З, З*), бутан-2,3-дион (К, К*), циклогексанон (С, С*)).

Флуоресценцию нанесенных на бумагу люминофоров возбуждали твердотельным лазером 405 нм мощностью 200 мВт. Спектры регистрировали в диапазоне 200–1100 нм с помощью спектрометра Maya 2000 Pro (Ocean Optics, США) с разрешением 0.5 нм. Время интегрирования – 1 с.

Оценку сорбционного сродства фаз на основе квантовых точек CdS/хитозан, органических люминофоров, комбинированных фаз на серебряных электродах по отношению к микроконцентрациям летучих молекул выполняли на многоканальных нановесах “MCNanoW-PQ” (ООО “Сенсорика – Новые Технологии”, Россия [25]) с восемью рабочими каналами. Для микровзвешивания сорбатов в режиме реального времени с высокой чувствительностью по массе применяли ПКР объемных акустических волн (масс-чувствительные AT-среза) с базовой частотой колебания кварцевой пластины 10.0 МГц с серебряными электродами диаметром 5 мм (ОАО “Пьезо”, Россия). Многоканальные нановесы связаны с индивидуальным программным обеспечением для регистрации изменения частоты колебания кварцевой пластины и массы в режиме реального времени с шагом 1 с и разрешением 1 Гц по модели Зауэрбрея.

Изменение частоты колебаний кварцевой пластины (–ΔF_i, Гц) прямо пропорционально массе сорбента за счет адсорбции на ней паров тест-веществ. Эта закономерность позволяет устанавливать прямые зависимости кинетики сорбции (скорость изменения сигнала), массы адсорбированных молекул (величина сигнала сенсора) с их природой и концентрацией в ячейке детектирования.

На многоканальных нановесах, оснащенных герметичной ячейкой из фторопласта объемом 140 см³, с открытым входом для фронтального ввода паров от индивидуального соединения, проводили эксперимент по изучению сорбционных свойств различных сорбентов. Режим измерения эффективности неравновесной сорбции: полное время (цикл измерения) составляет 200 с; нагрузка (выдерживание над пробой тест-вещества фиксированного объема) составляет 60 с, далее следует самопроизвольная регенерация системы, во время которой также регистрируется активность десорбции паров с фаз сорбентов.

Выходные сигналы пьезосенсоров – изменение частоты колебаний (–∆F_i. Гц) при сорбции/десорбции легколетучих веществ с шагом в 1 с фиксировались в виде хроночастотограмм (–ΔF_i = ƒ(τ), где τ – время измерения), максимальные сигналы пьезосенсоров (–F_max, Гц). Это наиболее полная регистрируемая характеристика и наиболее простой из рассчитываемых параметров соответственно.

Для оценки различий в сорбции легколетучих соединений и сравнения сорбционных свойств реагентов к определенным тест-веществам применяли максимальные аналитические сигналы двух сенсоров и рассчитывали коэффициент парной селективности:

$A\text{(}i\text{/}j\text{)}=\frac{-\Delta F_{\max i}}{-\Delta F_{\max j}},$

–ΔF_{max i,j,} Гц – фиксируемый максимальный за время нагрузки отклик сенсоров i и j соответственно. Соотношения таких сигналов характеризуют относительную скорость сорбции на фазах двух сорбентов.

Результаты и их обсуждение

Тест-планшеты для органических люминофоров. В идентичных условиях изучали и оценивали визуально с оцифровкой результата эффекты и взаимодействие органических реагентов КТ CdS, CdS/родамин 6G на бумажных подложках с растворами тест-веществ минимальной (физиологическая норма) и максимальной (не норма) концентраций. Рис. 1 и 2 на примере органических реагентов демонстрируют системы с имеющимися и отсутствующим откликами на тест-вещества. Полученные данные систематизированы в табл. 1, там же дан анализ аналитического отклика.

 

Рис. 1. Флуоресцентный отклик планшетов с ФЗ 12, ФЗ 14 с растворами тест-веществ (схема смешивания представлена в “Экспериментальной части”) при разных длинах волн источника возбуждения.

 

Рис. 2. Флуоресцентный отклик планшетов с ФЗ 28, ФЗ 32 с растворами тест-веществ (схема смешивания представлена в “Экспериментальной части”) при разных длинах волн источника возбуждения.

 

Таблица 1. Наблюдаемые визуально изменения в планшетных тест-системах органических люминофоров и водных растворов тест-веществ

Аналит	ФЗ 14	ФЗ 28	ФЗ 32
Ацетоуксусная к-та	Гашение люминесценции (*)	Не меняет свойств (–)	–
Уксусная к-та	*	–	–
Пропионовая к-та	*	Зелено-оранжевое свечение (254,365 нм), высокие концентрации	–
Масляная к-та	*	365 нм, гасит свечение высокая концентрация	365 нм, гасит свечение высокая концентрация
Молочная к-та	*	365 нм, гасит свечение высокая концентрация	365 нм, гасит свечение высокая концентрация
3-Фенилмолочная к-та	*	365 нм, гасит свечение любая концентрация	365 нм, гасит свечение высокая концентрация
Пероксид водорода	*	–	–
Ацетон	*	Зелено-оранжевое свечение (254,365 нм), высокие концентрации	–
Циклогексанон	*	–	–
Этаноламин	*	Зелено-оранжевое свечение (254,365 нм), любые концентрации	–
Аммиак	Зелено-голубое свечение (365, 254 нм), любые концентрации	Зелено-оранжевое свечение (254,365 нм), высокие концентрации	–
Бутиламин	Зелено-голубое свечение (365, 254 нм), любые концентрации	Зелено-оранжевое свечение (254,365 нм), любые концентрации	Зелено-оранжевое свечение (254 нм), любые концентрации
Триэтиламин	*	Зелено-оранжевое свечение (254, 365 нм), низкие концентрации	–
Изобутиламин	*	–	–
Циклопентиламин	*	–	Зелено-оранжевое свечение (254 нм), высокие концентрации
Аналог стеарина	*	Зелено-оранжевое свечение (254 нм), низкие концентрации	–
Аналог гормона	*	Зелено-оранжевое свечение (254 нм), низкие концентрации	Зелено-оранжевое свечение (254 нм), низкие концентрации
Вода	Слабое гашение	Гашение	Гашение

 

Используемые в данном исследовании флуоресцентные зонды класса азолотриазинов являются весьма стабильными полифлуорофорами, способными к фосфоресценции. Помимо этого, в зависимости от природы аналита имеет место цветовой переход в видимой части спектра (за счет наличия значительного количества бензольных фрагментов), что существенно упрощает процедуру регистрации эффекта взаимодействия и потенциально анализа.

Установлено, что наличие в структуре ФЗ таких функциональных групп, как карбоксильная и карбонильная способствует селективному и обратимому связыванию с первичными и вторичными аминами. Происходит образование ионных и/или водородных связей с кетонами и карбоновыми кислотами. Указанные взаимодействия приводят к существенному перераспределению электронных плотностей и снижению конформационной лабильности. Однако повышенная гидрофильность исследуемых зондов приводит к снижению доступности активных групп и, как следствие, к сглаживанию эффектов свечения в присутствии целевых аналитов. В связи с этим приоритетными направлениями изменения структуры люминофоров являются: увеличение липофильности и сохранение достаточной гидрофильности для обеспечения возможности взаимодействия с полярными молекулами. При этом контролируемыми свойствами структур-лидеров остается интенсивность флуоресценции, фотостабильность растворов и выраженность аналитического отклика (усиление/гашение люминофора).

В условиях многовариантности синтеза наиболее простым и доступным способом контроля является визуальная индикация на бумажных подложках или в планшетах. Однако при таких подходах могут быть некорректно оценены эффекты с парами летучих соединений.

Рис. 3 иллюстрирует влияние аммиака и метиламина на спектр флуоресценции ФЗ 32. И аммиак, и метиламин приблизительно вдвое усиливают свечение люминофора на бумажном носителе. Действие их обратимо: пары уксусной кислоты (кривая 4) тушат свечение люминофора до уровня несколько ниже исходного. Такая же картина наблюдается для ФЗ 28, что неудивительно, поскольку молекулы ФЗ 32 и ФЗ 28 отличаются единственным заместителем, незначительно влияющим на свойства ароматической системы. Основной причиной эффекта предположительно является ионизация фенольной группы, что типично для кислотно-основных индикаторов.

 

Рис. 3. Спектры флуоресценции ФЗ 32 на бумажном носителе при длине волны возбуждении 405 нм: исходный (1), под действием паров аммиака (2), метиламина (3) и уксусной кислоты (4).

 

Помимо указанного эффекта с парами аналитов, для ФЗ 28 и ФЗ 32 обнаружена чрезвычайно высокая чувствительность яркости люминесценции к присутствию катионных ПАВ. Хотя этот эффект не реализуется напрямую при детектировании паров, он указывает на высокую чувствительность спектров флуоресценции указанных молекул к окружению, причем эффект не сводится только к влиянию pH. Это позволяет положительно оценить возможности регулировки свойств аналитических систем в дальнейшем. Свойства флуоресцентного кислотно-основного индикатора проявляет также реагент ФЗ 12, однако свечение этого вещества подавляется только в присутствии сильной минеральной кислоты.

Оценка сорбционных свойств индивидуальных и смешанных фаз. Методом пьезокварцевого микровзвешивания сопоставлено сорбционное сродство паров некоторых классов соединений к веществам – потенциальным люминофорам: неорганическим (квантовые точки сульфида кадмия в хитозане), органическим соединениям и их комбинациям. Фазы КТ и органические фазы ФЗ 12, 14, 28, 32 близких масс проявляют разное сродство к парам органических соединений, воде, аммиаку (табл. 2). Для удобства представления данных пронумеровали фазы на ПКР: CdS (1), ФЗ 14 (2), ФЗ 12 (3), ГА/ФЗ 32 (5), CdS/ ФЗ 32 (6), ГА/ФЗ 28 (7), ГА (8).

 

Таблица 2. Максимальные отклики (–F_max, Гц) пьезовесов с фазами разных люминофоров в парах некоторых тест-веществ

Фазы сорбентов	Масса, мкг	Вода	Аммиак, 9%-ный раствор	Аммиак, повтор	Этанол 70%-ный	н-Бутиламин	Раствор уксусной кислоты
ФЗ 32	6.0	40	516*	50	51	318*	76
ФЗ 14	3.7	136	263	160	140	187*	394
ФЗ 25	3.0	130	257	160	140	110*	366
ФЗ 28	5.0	11	329*	20	20	150*	42
ФЗ 28/ ГА	20.5	200	113	85	–	350	105
ФЗ 12/ ГА	15.5	80	138	98	–	145	145

*Не происходит десорбции.

 

Установлено, что удельная скорость накопления паров за 1 мин (S_уд = (–ΔF_max)/(–ΔF_{сорбента}), Гц/мин) различается существенно как для органических, так и для комбинированных фаз (рис. 4). Органические люминофоры без подложки проявляют практически химическое сродство к аминам и к аммиаку (ФЗ 12, 14). Нанесение фазы на наноструктурированную подложку приводит к существенному изменению как эффективности, так и скорости сорбции паров.

 

Рис. 4. Зависимость удельной скорости накопления органическими и комбинированными люминофорами паров тест-веществ: воды (1), раствора аммиака (2), этанола (3), бутиламина (4), раствора уксусной кислоты (5).

 

Сопоставление результатов микровзвешивания разных по природе тест-веществ позволяет говорить о высокой избирательности фаз ФЗ 32, 28 к парам аммиака и аминов, а ФЗ 25 в большей степени к кислотам. Нанесение люминофоров на наноструктурированные фазы ГА и CdS (табл. 2) приводит к существенному нивелированию избирательности и чувствительности органических люминофоров и фаз подложек к аминам, кислотам. Если же такие фазы применять в качестве модификаторов газовых сенсоров, то по значениям параметра парной селективности сенсоров с фазами А(CdS// CdS/ФЗ 32) высокоизбирательно на фоне паров воды идентифицируются пары циклопентиламина, аммиака, метоксиэтанамина, изобутиламина, бутиловых спиртов (табл. 3). Анализ всех возможных параметров парной селективности пьезосенсоров с изученными индивидуальными и смешанными органическими, неорганическими модификаторами позволил выделить наиболее надежные и высокочувствительные (табл. 4). Анализ данных показал, что подложка из гидроксиапатита сильно ускоряет сорбцию, при этом снижается дифференциация паров; фазы ФЗ 28 и ФЗ 14 на воду не реагируют, хорошо дифференцируют амины, особенно алкиламины. При этом даже подложка из ГА не меняет этой высокой селективности.

 

Таблица 3.Расчетные параметры парной селективности А(i/j) ПКР с фазами КТ и органическими люминофорами при сорбции паров тест-веществ в закрытой ячейке детектирования

Тест-вещество	Номер сенсора для расчета А
	1\2	1\3	1\5	1\6	1\7	1\8	2\3	2\5	2\6	2\7	2\8	3\8	5\6	5\7	5\8	6\7	6\8	7\8
Вода 5 мл	0.65 ± 0.04*	0.36 ± 0.03	0.47 ± 0.03	0.51 ± 0.05	0.19 ± 0.02	0.05 ± 0.01	0.56 ± 0.01	0.70 ± 0.10	0.79 ± 0.10	0.29 ± 0.02	0.07 ± 0.02	0.13 ± 0.03	1.1 ± 0.1	0.40 ± 0.10	0.10 ± 0.03	0.37 ± 0.04	0.09 ± 0.04	0.25 ± 0.04
Этилацетат	0.25	0.42	0.17	0.37	0.24	0.04	1.7	0.68	1.5	0.99	0.18	0.10	2.2	1.5	0.26	0.66	0.12	0.18
Молочная кислота	0.59	0.43	0.38	0.13	0.24	0.06	0.72	0.64	0.22	0.40	0.10	0.14	0.45	0.59	0.15	0.63	0.13	0.26
Метилэтилкетон	0.27	0.69	0.23	0.34	0.42	0.08	2.6	0.85	1.3	1.6	0.29	0.11	1.5	1.9	0.34	1.2	0.23	0.18
Этанол	0.31	0.48	0.27	0.40	0.27	0.08	1.6	0.87	1.3	0.88	0.25	0.16	1.5	1.0	0.29	0.70	0.20	0.29
Бутанол-1	0.33	0.83	0.40	0.60	0.48	0.15	2.5	1.2	1.8	1.4	0.45	0.18	1.5	1.2	0.37	0.81	0.25	0.31
Пропиламин	0.10	0.36	0.17	0.29	0.17	0.17	1.4	0.50	0.63	0.27	0.27	0.55	1.7	1.0	1.1	0.58	0.60	1.0
Циклопентиламин	0.23	0.42	0.40	0.90	0.26	0.22	1.9	1.8	4.2	1.2	1.0	0.52	2.3	0.63	0.54	0.28	0.24	0.85
Аммиак	0.42	1.6	0.58	1.1	1.0	0.25	4.0	1.4	2.7	2.4	0.61	0.15	1.9	1.7	0.45	0.93	0.24	0.26
Изобутиламин	0.22	0.47	0.29	0.66	0.22	0.26	2.1	1.4	3.1	1.0	1.2	0.63	2.3	0.76	0.91	0.34	0.41	1.2
Бутиламин	0.29	0.35	0.28	0.49	0.21	0.28	1.2	0.97	1.7	0.74	0.97	0.79	1.8	0.76	1.0	0.43	0.56	1.3
Метоксиэтанамин	0.23	0.75	0.88	1.5	0.41	0.31	3.3	3.8	6.6	1.8	1.4	0.41	1.7	0.46	0.35	0.27	0.20	0.77

*Доверительный интервал (n = 3, Р = 0.95).

 

Таблица 4. Высоконадежные параметры парной селективности пьезокварцевых резонаторов с фазами квантовых точек и органическими люминофорами

Тест-вещество	Фаза КТ
	CdS/ ФЗ 14	CdS/ ФЗ 12	CdS/ ГА с ФЗ 32	CdS/ ГА с ФЗ 28	ФЗ 14/ ФЗ 12	ФЗ 12/ ГА с ФЗ 32	ГА с ФЗ 32/ CdS c ФЗ 32
Вода	0.65	–	–	–	0.56	–	1.1
Этанол	–	–	–	–	–	–	–
Бутанол-1	–	–	–	–	–	–	–
Метилэтилкетон	–	–	–	–	–	–	–
Этилацетат	–	–	–	–	–	–	–
Молочная к-та	–	–	–	–	0.72	–	–
Метоксиэтан-амин	–	–	0.88	–	3.3	–	–
Циклопентиламин	–	–	–	–	–	–	–
Пропиламин	0.10	–	–	–	–	–	–
Изобутиламин	–	–	–	–	–	0.70	–
Бутиламин	–	–	–	–	–	0.79	–
Аммиак	0.42	1.6	–	1.0	4.0	–	–

 

Высоконадежно идентифицируются амины и аммиак, молочная кислота. А среди этих соединений фазы люминофоров позволяют идентифицировать раздельно: аммиак, воду (как микропримесь), метоксиэтанамин, пропиламин, бутиламины. Именно эти соединения часто входят в набор паттернов летучих соединений, характерных для распространенных социально значимых заболеваний (табл. 5).

 

Таблица 5. Примеры летучих органических соединений – биомаркеров для некоторых заболеваний (составлено по материалам [2])

Заболевания / характерные нарушения метаболизма	Некоторые летучие органические соединения диагностических паттернов
Расстройство дыхательной системы (астма)	Бутановая (масляная) кислота, п-гидроксибензальдегид, гексанон, пентанон, 1-гидрокси-2-пентанон, сульфиды, гептанон, метилциклогексанолы, бутанон
Колоректальный рак	п-Гидроксибензальдегид, этанол (продукт гликолиза)
Язвенный колит	Ацетон, этанол (продукт гликолиза), бутанолы
Эозинофильный эзофагит	4-Аминобутановая кислота, этанол (продукт гликолиза)
Печеночная энцефалопатия	4-Аминобутановая кислота
Расстройство нервной системы (болезнь Альцгеймера), алкоголизм, психические расстройства (депрессия, алкогольный синдром, шизофрения)	Ацетальдегид (этаналь), 4-аминобутановая кислота, кетоны (ацетон, дигидроксиацетон, циклогексанон, циклопентанон, ацетилацетон, 4-метил-2(3)-пентанон, 2-гексанон), 2-метилпентаналь, геканаль, акрилонитрил
Рак легких, органическая ацидемия, заболевание кленовым сиропом, расстройство центральной нервной системы	Уксусная кислота, этанол
Алкаптонурия, цистиноз, фенилкетонурия, саркозинемия, тирозинемия, расстройство кровеносной и лимфатической системы, уремия, почечная недостаточность, эозинофильный эзофагит	Аммиак, диметиламин, триметиламин

 

Полученная информация согласуется с откликами визуальной планшетной тест-системы и флуоресценции фаз, нанесенных на бумажные носители. Однако уровень согласованности, строго говоря, не является максимально корректным, так как концентрация реагентов и аналитов при этом различаются значительно.

Оценка согласованности методов. Очевидно, что изменения флуоресцентного отклика и эффективности сорбции органических фаз и КТ должны быть вызваны связыванием с парами органических соединений за счет более сильных взаимодействий, чем сорбционные, поверхностные, даже водородные и донорно-акцепторные.

Для сравнения согласованности результатов применения в исследовании фаз различных методов (планшетная видимая спектроскопия (ВФл), флуориметрия (СФл), прямое микровзвешивание (ПКМ)) предложено использовать коэффициент конкордации r, который является мерой согласованности мнений экспертов в органолептических испытаниях [26]. Применяемые методы (m = 3) будем рассматривать как экспертов свойств в системах органических, неорганических флуоресцентных реагентов и тест-веществ (изученных на данном этапе), которые, в свою очередь, выбраны факторами (n = 28). Ранговыми оценками будем считать следующие эффекты: 0 – отсутствие селективности при сорбции на выбранных фазах, отсутствие видимых эффектов, а также каких-либо изменений флуоресцентных свойств при взаимодействии реагентов и аналитов; 1 – установленная избирательность, селективность детектирования аналитов (тест-веществ) всеми методами; 2 – интенсивные изменения откликов аналитических систем во всех методах (табл. 6). Для каждого из выбранных методов и способов фиксирования взаимодействия в системе люминофор–аналит кодировали эффекты по следующим признакам: выбирали изменения, которые в системе являются для конкретного вещества отличительными среди всего набора тестируемых в выборке.

 

Таблица 6. Сводная матрица рангов методов по результатам оценки изменений флуоресценции и сорбции в системах с квантовыми точками CdS при действии паров и растворов тест-веществ

Тест-вещество	ПКМ	СФл	ВФл	Тест-вещество	ПКМ	СФл	ВФл
Бутанол-1	0	0	0	Метанпентанол-2	0	0	0
Метилэтилкетон	0	0	0	5-Метилгексанон	0	0	0
Этанол	1	1	0	Бензальдегид	0	0	0
Ацетилацетон	1	0	0	Пропанол-2	0	0	0
Малоновый эфир	0	0	0	Ацетон	0	1	0
Вода	0	0	0	Ацетальдегид	0	0	0
Салициловый альдегид	0	0	0	Гексан	0	0	0
Пиридин	1	0	0	Аммиак	1	0	1
Диоксан	0	0	0	Метиламин	1	1	1
Морфолин	1	1	1	Пероксид водорода	1	0	1
Аминол	1	0	1	Бутанол-2	0	0	0
Пропиламин	1	1	1	Пропиламин	1	1	1
Ацетон	0	1	1	Фениламин	1	1	0
Диэтаноламин	1	1	1	Молочная кислота	0	0	0

 

В планшетных тест-системах отсутствие визуального изменения цвета и интенсивности свечения трактовалось как не влияющее на структуру люминофора взаимодействие либо его эффект незначителен с аналитической точки зрения, отсутствует значимый отклик системы. Такой аналитический эффект кодировали как “0”. Изменения на планшетах оценивали при естественном освещении, 365 и 256 нм. Изменение цвета или усиление/гашение свечения лунок с раствором реагента и аналита хотя бы при одном источнике излучения по сравнению с раствором чистого реагента кодировали как “+1”. Если устойчивый эффект изменения наблюдался при всех условиях регистрации, то результат взаимодействия в системе кодировали как “+2”.

Для флуориметрии в качестве объекта кодировки выбрали величину аналитического сигнала: отсутствие изменений интенсивности излучения в системе (изменение аналитического сигнала на уровне шумов) кодировали как нулевой отклик с присвоением кода “0”, незначительное изменение излучения (3−6 уровней шума) без смещения исходной длины волны в системе кодировали как возникающий ответ в системе и этому эффекту присваивали код “+1”, если изменения интенсивности свечения или гашения более чем в два раза превышали исходные значения или наблюдалось смещение длины волны излучения, то аналитический сигнал в системе считали значимым и значительным, такой эффект кодировали кодом “+2”.

В наиболее чувствительном и экспрессном методе изучения сорбции паров соединений на фазах с малым содержанием реагента – пьезокварцевом микровзвешивании – как при нагрузке (контакт с аналитом), так и при десорбции (исключен контакт с парами) регистрируются скорость изменения массы сорбента, полнота его регенерации за определенный момент времени. Минимизация времени измерения соответствует задачам тест-методов, а для сорбционных методов наиболее информативным является начальный кинетический участок сорбции/десорбции. Это позволяет в первом приближении оценивать порядок реакции, обратимость взаимодействия. Если скорости приращения и убыли массы за определенный промежуток времени равны или близки, а максимальный сигнал сенсора за время нагрузки парами значим (> 6σ, где σ – шум системы), то система обратимая, сорбция неспецифическая и эффект взаимодействия кодировали как “0”. Если сигнал сенсора за время нагрузки составлял ≤ 6σ, то кодировали как “–1”. Если в сорбционной системе существенно отличались скорости сорбции и десорбции при аналитическом сигнале, составляющем >6σ, то эффект взаимодействия кодировали как “+2”. Такому поведению сорбционной системы соответствует также дрейф базовой линии пьезовесов с сорбентом. Базовая линия может быть возрастающей, когда наблюдается унос части сорбента, или убывающей, когда происходит неполная десорбция в условиях эксперимента. Эти эффекты соответствуют интенсивному взаимодействию сорбата и сорбента. После кодировки составляли матрицу оценок взаимодействия разными методами (табл. 6).

Так как в матрице имеются связанные ранги (одинаковый ранговый номер) в оценках всеми методами, последовательно проводили переформирование оценок. На основании переформирования рангов строили новую матрицу оценок изменения свойств аналитических систем при контакте с выбранными тест-веществами (табл. 7).

 

Таблица 7. Сводная матрица преобразованных оценок результатов флуоресцентных изменений и сорбционных взаимодействий в системах с квантовыми точками CdS и тест-веществами

Тест-вещество	ПКМ	СФл	ВФл	Тест-веществ	ПКМ	СФл	ВФл
Бутанол-1	8.5	10	10	Метанпентанол-2	8.5	10	10
Метилэтилкетон	8.5	10	10	5-Метилгексанон	8.5	10	10
Этанол	22.5	24	10	Бензальдегид	8.5	10	10
Ацетилацетон	22.5	10	10	Пропанол-2	8.5	10	10
Малоновый эфир	8.5	10	10	Ацетон	8.5	24	10
Вода	8.5	10	10	Ацетальдегид	8.5	10	10
Салициловый альдегид	8.5	10	10	Гексан	8.5	10	10
Пиридин	22.5	10	10	Аммиак	22.5	10	24
Диоксан	8.5	10	10	Метиламин	22.5	24	24
Морфолин	22.5	24	24	Пероксид водорода	22.5	10	24
Аминол	22.5	10	24	Бутанол-2	8.5	10	10
Пропиламин	22.5	24	24	Пропиламин	22.5	24	24
Ацетон	8.5	24	24	Фениламин	22.5	24	10
Диэтаноламин	22.5	24	24	Молочная кислота	8.5	10	10

 

Среднюю степень согласованности мнений всех экспертов (результатов методов) оценивали по коэффициенту конкордации Кендалла для случая, когда имеются связанные ранги (одинаковые значения рангов в оценках одного метода). Коэффициент конкордации Кендалла для трех методов оценки эффективности взаимодействия на фазе CdS/хитозан для 28 тест-веществ составляет W = 0.70. Это говорит о наличии средней степени согласованности результатов. Установлено, что это значение – величина не случайная, поэтому полученные результаты подчиняются определенной функциональной связи.

Средняя степень согласованности предсказания активности фазы CdS/хитозан по отношению к парам 28 аналитов тремя методами подтверждает влияние условий выполнения эксперимента на результаты ранговой корреляции. Доминирующими являются чувствительность фаз к парам тест-веществ, влияние растворителей на эффекты взаимодействия. Так, метод планшетной визуальной оценки флуоресценции при двух длинах волн возбуждения (365, 254 нм) существенным образом отличается от флуориметрии и микровзвешивания паров фазами КТ на бумаге и ПКР. Если сравнить согласованность оценок близких по условиям методов – флуоресценции зон КТ и микровзвешивания фазы КТ при обработке парами аналитов, то коэффициент конкордации Кендалла этих методов иной.

На примере малой выборки аналитов, которые однозначно были выделены по результатам ПКМ (табл. 8) как специфически и селективно сорбируемые фазай КТ, оценили согласованность с результатами оценки изменения флуоресценции в парах этих веществ высокой концентрации. Для полученных двумя методами данных согласованность результатов составляет W = 0.89 (величина не случайная, говорит о наличии высокой степени согласованности результатов разных методов). На основании полученного коэффициента ранговой корреляции для двух методов вычислили показатели весомости предсказания эффективности взаимодействия для 33 аналитических систем (табл. 9).

 

Таблица 8. Ранговая оценка результатов и изменений в тест-системах с неорганической, органическими и комбинированными фазами

№ п/п	Тест-вещество	Пьезокварцевое селективное микровзвешивание	Изменение флуоресценции в парах аналитов (ƛвозб = 405 нм)
Фаза CdS/хитозан
1	Аммиак (9%-ный водный раствор)	0	0
2	Метиламин	1	0
3	Морфолин	2 (значительно)	2 (гашение свечение)
4	Ацетон	1	1 (усиление свечения)
5	Уксусная кислота	1	0
6	Формальдегид	0	0
7	Пропанол-1 (спирты С2−С4)	0	0
Фаза CdS/хитозан/Родамин 6G
8	Аммиак ( 9%-ный водный раствор)	1	1 (гашение свечения)
9	Метиламин	1	1 (гашение свечения)
10	Морфолин	1	0
11	Ацетон	1	0
12	Уксусная к-та	1	1 (гашение свечения)
13	Формальдегид	0	0
14	Пропанол-1 (спирты С2−С4)	0	0
Фаза CdS/хитозан/ФЗ 12
15	Аммиак (9%-ный водный раствор)	0	0
16	Метиламин	0	0
17	Морфолин	1	1 (гашение свечения)
18	Ацетон	1	1 (гашение свечения)
19	Уксусная к-та	0	0
20	Формальдегид	0	1 (усиление свечения)
21	Пропанол-1 (спирты С3−С4)	0	0
ФЗ 32
22	Аммиак	2	2 (усиление свечения)
23	Метиламин	2	2 (усиление свечения)
24	Ацетон	0	0
25	Пропанол-1	0	0
ФЗ 28
26	Аммиак	1	1 (усиление свечения)
27	Метиламин	1	1 (усиление свечения)
28	Ацетон	0	0
29	Пропанол-1	0	0
ФЗ 14
30	Аммиак	1	1 (гашение свечения)
31	Метиламин	1	2 (гашение свечения)
32	Ацетон	0	0
33	Пропанол-1	0	0

 

Таблица 9. Матрица преобразованных рангов оценок двумя методами по эффективности взаимодействия флуоресцентных фаз и паров тест-веществ

Тест-вещество*	ПКМ	СФл	∑	Вес λ	Тест-вещество*	ПКМ	СФл	∑	Вес λ
1	2	2	4	0.04255	18	1	1	2	0.02128
2	1	2	3	0.03191	19	2	2	4	0.04255
3	0	0	0	0	20	2	1	3	0.03191
4	1	1	2	0.02128	21	2	2	4	0.04255
5	1	2	3	0.03191	22	0	0	0	0
6	2	2	4	0.04255	23	0	0	0	0
7	2	2	4	0.04255	24	2	2	4	0.04255
8	1	1	2	0.02128	25	2	2	4	0.04255
9	1	1	2	0.02128	26	1	1	2	0.02128
10	1	2	3	0.03191	27	1	1	2	0.02128
11	1	2	3	0.03191	28	2	2	4	0.04255
12	1	1	2	0.02128	29	2	2	4	0.04255
13	2	2	4	0.04255	30	1	1	2	0.02128
14	2	2	4	0.04255	31	1	0	1	0.01064
15	2	2	4	0.04255	32	2	2	4	0.04255
16	2	2	4	0.04255	33	2	2	4	0.04255
17	1	1	2	0.02128	Итого			94	1

*Номер соответствует порядковому номеру строки в табл. 8.

 

Оба метода показали полную согласованность оценки эффективности взаимодействия с парами морфолина фазы КТ CdS/хитозан; паров аммиака, метиламина с комбинированной фазой CdS/хитозан//ФЗ 12; паров метиламина и фазы ФЗ 14. Наименьшая согласованность оценки взаимодействия и ожидаемого эффекта изменения флуоресценции относится к 15 аналитическим системам с разными по природе фазами и органическими веществами (раствор аммиака, формальдегид, спирты С₂−С₄, метиламин с комбинированной фазой CdS/хитозан//родамин 6 G; ацетон, раствор уксусной кислоты) практически со всеми изученными фазами. Полученные результаты подтверждают правильную стратегию синтеза органических флуориметрических реагентов для возможного применения в аналитических тест-системах, например, для оценки процессов воспаления в организме по изменениям в биопробах, деструкции белков в пищевых системах.

* * *

Установлено, что согласованность результатов методов оценки степени взаимодействия паров аналитов по изменению флуоресценции фаз и чувствительности сорбции высокая. Этот факт можно применять для значительного сокращения времени оценки действия паров разных соединений и флуоресцентных фаз разной природы (органические и неорганические) в первом приближении. На наш взгляд, неполная корреляция оценок для тест-веществ связана с разной чувствительностью методов и ограничением концентрации при изучении сорбционных свойств фаз методом ПКМ. Полученные данные согласуются с результатами сопоставления изменения флуоресценции и эффективности пьезокварцевого микровзвешивания для некоторых органических и неорганических газов [28−30]. Сокращение времени и расхода реагентов на стадии поиска пути синтеза и направленного изменения свойств органических и неорганических реагентов значительно повышает эффективность исследований.

Финансирование работы

Синтез и исследование органических реагентов выполнены при поддержке гранта Президента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых – кандидатов наук (проект МК-4978.2022.1.3)

Синтез и исследование квантовых точек сульфида кадмия и фаз на его основе выполнены при финансовой поддержке гранта РНФ 23-23-00609.

Конфликт интересов

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

T. А. Kuchmenko

Voronezh State University of Engineering Technologies; Vernadsky Institute of Geochemistry and Analytical Chemistry, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: tak1907@mail.ru
Russian Federation, 394036, Voronezh; 119334, Moscow

D. Yu. Vandychev

Voronezh State University

Email: tak1907@mail.ru
Russian Federation, 394006, Voronezh, Universitetskaya Square, 1

V. V. Yagov

Vernadsky Institute of Geochemistry and Analytical Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: tak1907@mail.ru
Russian Federation, 119334, Moscow

R. U. Umarhanov

Voronezh State University of Engineering Technologies

Email: tak1907@mail.ru
Russian Federation, 394036, Voronezh

I. V. Ledeneva

Voronezh State University

Email: tak1907@mail.ru
Russian Federation, 394006, Voronezh, Universitetskaya Square, 1

References

Supplementary files