Human eRT1 Translation Regulation

Capa

Citar

Texto integral

Resumo

Translation termination factor eRF1 is an important cellular protein that plays a key role in translation termination, nonsense-mediated mRNA decay (NMD), and stop-codons readthrough. An amount of eRF1 in the cell influences all these processes. The mechanism of eRF1 translation regulation through an autoregulatory NMD-dependent expression circuit has been described for plants and fungi, but the mechanisms of human eRF1 translation regulation have not yet been studied. Using reporter constructs, we studied the effect of eRF1 mRNA elements on its translation in cell-free translation systems and HEK293 cells. Our data do not support the presence of the NMD-dependent autoregulatory circuit of human eRF1 expression. We found that the 5'-untranslated region (5'-UTR) of eRF1 mRNA and the start codon of the upstream open reading frame (uORF) have the greatest influence on the translation of CDS. According to the DataBase of Transcriptional Start Sites (DBTSS), eRF1 mRNA has a high heterogeneity of transcription start sites and variable length of 5'-UTRs as a consequence. Moreover, the start codon of the eRF1 CDS is located within the known Translation Initiator of Short 5′UTR (TISU), which also stimulates mRNA transcription of genes with high transcription start heterogeneity. We hypothesize that regulation of eRF1 mRNA translation occurs at both the transcriptional and translational levels. At the transcription level, the length of the 5'-UTRs of eRF1 and the number of short open reading frames in it are regulated, which in turn regulate eRF1 production at the translational level.

Texto integral

Сокращения:

NMD – нонсенс-опосредованный распад; 5′- и 3′-НТО – нетранслируемые области мРНК; ОРС – открытая рамка считывания; кОРС – короткая открытая рамка считывания; EJC – комплекс сращивания экзонов; Fluc (Fl) – люцифераза светлячка; Nluc (Nl) – нанолюцифераза; HBB – β-глобин; ETF1 – символ гена, кодирующего eRF1; GAPDH – глицеральдегидфосфат-дегидрогеназа; ПСК – преждевременный стоп-кодон; ССТ – сайты старта транскрипции; О.Е.Л. – относительные единицы люминесценции.

ВВЕДЕНИЕ

Фактор терминации трансляции eRF1 – основной фактор, обеспечивающий терминацию трансляции в клетках эукариот. eRF1 состоит из трех функциональных доменов: N-домен вовлечен в распознавание стоп-кодона [1–6], М-домен обеспечивает гидролиз пептидил-тРНК в P-сайте рибосомы [7], а C-домен связывается с дополнительным фактором терминации трансляции eRF3 [8–13]. Кроме того, eRF1 вовлечен в регуляцию сквозного прочтения [14–16], в нонсенс-опосредованный распад (NMD) мРНК [17–20], преждевременную терминацию на некоторых редких смысловых кодонах [21, 22].

Терминация ‒ это важный этап трансляции, на котором регулируется скорость и эффективность высвобождения новосинтезированных пептидов. Показано, что терминация трансляции на кОРС в 5′-нетранслируемой области (5′-НТО) мРНК ряда генов обеспечивает регуляцию трансляции основного продукта [23]. Изучение терминации трансляции имеет и прикладное значение. До 10% орфанных генетических заболеваний человека связаны с возникновением преждевременных стоп-кодонов (ПСК), а терапия таких заболеваний направлена на увеличение сквозного прочтения ПСК [24].

Сквозное прочтение стоп-кодонов и преждевременная терминация являются противоположными процессами, зависящими от концентрации eRF1 и конкурирующих тРНК [21, 25]. При сквозном прочтении происходит удлинение белкового продукта с C-конца за счет распознавания стоп-кодона конкурирующей близкородственной тРНК, что в некоторых случаях может быть частью нормальных физиологических процессов клетки [26–28]. Менее изученный процесс преждевременной терминации на смысловых кодонах описан у прокариот, грибов и дрозофил, обсуждается его более широкая представленность у эукариот [21, 22, 29]. Предполагается, что физиологический смысл преждевременной терминации на смысловых кодонах заключается в высвобождении “застрявших” на мРНК рибосом, и этот механизм является альтернативой No-go-деградации мРНК (NGD).

NMD – процесс деградации мРНК, обусловленный наличием ПСК, может стимулироваться комплексом сращивания экзонов (EJC – Exon Junction Complex) на определенном расстоянии после стоп-кодона. Основная функция NMD заключается в контроле качества и удалении ошибочно возникающих мРНК с ПСК в результате нарушений сплайсинга. Кроме того, имеется множество свидетельств участия NMD в регуляции нормальной экспрессии генов. мРНК могут подвергаться NMD и в отсутствие ошибочного соединения экзонов и появления ПСК. Такие события могут обуславливаться либо EJC-независимым NMD, либо неканоническим расположением EJC. Вероятность NMD при этом тем выше, чем длиннее 3′-НТО [19].

Таким образом, исследование продукции eRF1 имеет важное значение, так как уровень этого белка в клетке будет определять эффективность важных клеточных процессов, описанных выше. Экспрессия гена ETF1, кодирующего eRF1 человека, изучена на уровне транскрипции [30], однако отсутствуют работы о регуляции трансляции eRF1 у млекопитающих. Стоит отметить, что описан авторегуляторный контур экспрессии eRF1 у растений и грибов. При высоком содержании eRF1 запускается механизм распада собственной мРНК, обусловленный наличием EJC после первого стоп-кодона, компетентного для стимулирования NMD. Из-за этого снижается количество eRF1 в клетке, происходит сквозное прочтение стоп-кодона собственной мРНК, что ингибирует ее NMD [31, 32].

В представленной работе с помощью конструкций мРНК, включающих кодирующие последовательности репортеров люциферазы светлячка (Fluc – Firefly luciferase) или нанолюциферазы (Nluc – Nano luciferase), нами изучено влияние элементов мРНК eRF1 (5′-НТО, ОРС, 3′-НТО) на трансляцию. Показано, что основной вклад в регуляцию трансляции вносит 5′-НТО мРНК eRF1 и находящиеся в ней дополнительные старт-кодоны. Наиболее вероятным механизмом контроля трансляции eRF1 является регуляция длины ее 5′-НТО за счет частоты использования сайтов инициации транскрипции.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клонирование 3′-НТО мРНК eRF1. Тотальную РНК HEK293 выделяли с помощью ExtractRNA (“Evrogen”, BC032, Россия) по протоколу производителя. Эту РНК использовали для получения кДНК с помощью AMV Reverse Transcription System (“Promega”, A3500, США) с олиго(dT)15 или случайными праймерами (табл. S1). С помощью праймеров CDS F и олиго(dT)15 (табл. S1, дополнительные материалы размещены в электронном виде по DOI: S0026898424040091 статьи, а также размещены на сайте http://www.molecbio.ru/downloads/2024/4/supp_Shuvalov_rus.pdf) был получен ПЦР-продукт, который клонировали в TA-вектор pGEM®-T Easy Vector (“Promega”, A1360). Клонированный продукт содержал часть ОРС eRF1 и последовательность 3′-НТО мРНК eRF1, включающую 861 нуклеотид после стоп-кодона UAG ОРС eRF1 и далее A(15).

Создание экспериментальных конструкций и синтез мРНК. Конструкции Nl c ПСК и контроли с кодирующими кодонами. Плазмидa pNl-gl описана ранее [33]. В конструкцию pNl-gl по NcoI-сайту рестрикции вставили частичную последовательность ОРС β-глобина с ПСК UGA и контекстом CUAGUA (слабый), усиливающим сквозное прочтение [34, 35]. Старт-кодон в последовательности гена β-глобина заменили на ATA, используя набор QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (“Agilent”, США), и получили плазмиду UGA_Nl. С использованием этого же набора получены и все остальные плазмиды: UGU_Nl, UAA_Nl/AAA_Nl, UAG_Nl/UAU_Nl.

Конструкции Nl для изучения сквозного прочтения стоп-кодонов мРНК eRF1. На плазмиде pNl-gl с праймерами pNl F/R получен ПЦР-продукт Nl. С помощью праймеров 5′1 F/R, 5′2 F/R, 5′2 F и 5′2sense R (табл. S1, см. Дополнительные материалы на сайте http://www.molecbio.ru/downloads/2024/4/supp_Shuvalov_rus.pdf) получены соответствующие ПЦР-продукты. С помощью системы Gibson Assembly (“NEB”, E2611L, США) из ПЦР-продуктов Nl, 5′1 и 5′2 получена плазмида 5′_Nl (1), а из ПЦР-продуктов Nl, 5′1 и 5′2sense плазмида 5′sense_Nl (1), в которой стоп-кодон TAG кОРС мРНК eRF1 заменен на TCG, кодирующий серин (табл. S2). На плазмиде pNl-gl с праймерами pNl F и pNl-gl R (табл. S1) получен ПЦР-продукт Nl-gl. С помощью системы Gibson Assembly (“NEB”, E2611L) из ПЦР-продуктов Nl-gl и 5′2 получена плазмида 5′_Nl (3), а из ПЦР-продуктов Nl-gl и 5′2sense – плазмида 5′sense_Nl (3) (табл. S2). На полученной нами ранее плазмиде petSUMO-eRF1 с помощью пар праймеров pNl_eRF1 F/R, pNl_eRF1 F и pNl_eRF1-Ser R (табл. S1) синтезировали ПЦР-продукты ОРС и ОРСsense. С помощью системы Gibson Assembly (“NEB”, E2611L) из ПЦР-продуктов Nl-gl и ОРС получена плазмида ОРС_Nl, а из ПЦР-продуктов Nl-gl и ОРСsense – плазмида ОРСsense_Nl, в которой стоп-кодон TAG ОРС eRF1 заменен на TCG, кодирующий серин (табл. S2). Конструкция с ОРС eRF1 содержала дополнительно природную 3′-контекстную последовательность из 9 нуклеотидов после стоп-кодона UAG.

Конструкции Fluc для изучения влияния на трансляцию 5′- и 3′-НТО мРНК eRF1. На плазмиде pGEM-Fluc (“Promega”, кат. № E1541) с использованием праймеров Fl F/R получен ПЦР-продукт Fl. С использованием праймеров 3′GAPDH F/R получен ПЦР-продукт 3′GAPDH. С помощью системы Gibson Assembly (“NEB”, E2611L) из ПЦР-продуктов Fl и 3′GAPDH получена плазмида Fl_3′GAPDH (табл. S2). С использованием праймеров 3′ F и 3′ R на плазмиде pGEM-3′eRF1 получен ПЦР-продукт 3′eRF1. С помощью системы Gibson Assembly (“NEB”, E2611L) из ПЦР-продуктов Fl и 3′eRF1 получена плазмида Fl_3′eRF1 (табл. S2). С использованием праймеров 5′_Fl F/R и плазмид 5′_Nl (1) и 5′sense_Nl (1) получены ПЦР-продукты 5′_Fl и 5′sense_Fl. ПЦР-продукт 5′_Fl был вставлен в плазмиды Fl_3′GAPDH и Fl_3′eRF1 по сайтам рестрикции NheI и XbaI для получения конструкций 5′eRF1_Fl_3′GAPDH и 5′eRF1_Fl_3′eRF1, а ПЦР-продукт 5′sense_Fl вставлен в плазмиду в Fl_3′eRF1 для получения 5′eRF1sense_Fl_3′eRF1 (табл. S2).

Использованные в работе мРНК получены из соответствующих ПЦР-продуктов, содержащих вносимые праймерами Т7 промотор на 5′-конце и поли(A)50-хвост на 3′-конце, с помощью набора T7 RiboMAX™ Large Scale RNA Production System (“Promega”) с добавлением аналога кеп-структуры мРНК (ARCA, “NEB”) согласно протоколу производителя. Список мРНК и названия праймеров, использованных для их синтеза, приведены в дополнительных материалах (табл. S2, см. Дополнительные материалы).

Выделение и очистка рекомбинантного eRF1. Рекомбинантный eRF1 получали из ранее созданной нами конструкции petSUMO-eRF1, как описано для NSP1 [33], проводили дополнительную очистку препарата eRF1 с помощью ионообменной хроматографии на колонке HiTrap Q HP (“Cytiva”).

In vivo и in vitro трансляция в бесклеточных системах трансляции и клетках HEK293. Трансляцию репортерных мРНК осуществляли в 10 мкл смеси, содержащей 50% лизата HEK293, 20 мМ HEPES-KOH pH 7.5, 2 мМ DTT, 0.25 мМ спермидина, 0.6 мМ MgAc2, 16 мМ креатинфосфат, 0.06 ед/мкл креатинкиназы, 1 мМ ATP, 0.6 мМ GTP, 60 мМ KAc, 0.05 мМ каждой аминокислоты, 0.2 ед/мкл RiboLock, 0.5 мМ D-люциферин (или 1% Nano-Glo® (“Promega”)). eRF1 добавляли до конечной концентрации 0.6 мкМ. Интенсивность люминесценции измеряли при 30°C в планшетном ридере Tecan Infinite 200 Pro в течение 100 мин. Эффективность трансляции рассчитывали как максимальную производную растущего линейного участка кривой люминесценции (v0, RLU/мин). Сквозное прочтение стоп-кодона рассчитывали как отношение эффективности трансляции матрицы с ПСК к эффективности трансляции контрольной матрицы со смысловым кодоном в данном положении.

In vivo трансляцию репортеров осуществляли в клетках HEK293 в соответствии с ранее описанным методом FLERT (Fleeting mRNA Transfection technique) [38]. Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота при 37°C и 5% CO2. За день до трансфекции экспоненциально растущие клетки HEK293 рассаживали на 24-луночные планшеты с плотностью покрытия 50%. Через 12–16 ч роста, когда плотность клеток достигала 70–90%, проводили трансфекцию с использованием GenJector™-U (“Molecta”, Россия) для РНК. Для этого 0.5 пмоль репортерной мРНК и 0.05 пмоль контрольной мРНК инкубировали с 0.2 мкл реагента для трансфекции в 60 мкл Opti-MEM (“Gibco”, 11058–021) в течение 10 мин, а затем добавляли в питательную среду к клеткам HEK293T в соответствующую лунку. Через 2 ч клетки собирали, активность люциферазы анализировали с помощью системы люциферазы Dual Luciferase® (“Promega”). Трансфекцию повторяли несколько раз в разных клеточных пассажах.

Статистический анализ. Эксперименты проводили в трех и более повторах. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SE). Для сравнения средних значений между двумя группами использовали непарный двусторонний t-критерий. Множественные сравнения проводили с использованием поправки Холма на значение p [36]. Звездочками отмечены статистически значимые различия (*р < 0.05; **р < 0.01; ****p < 0.0001).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Организация мРНК eRF1

Референсная последовательность мРНК eRF1 человека в базе данных NCBI RefSeq имеет идентификационный номер NM_004730. Схема этой мРНК c аннотированными в базе данных GenBank элементами представлена на рис. 1а. мРНК eRF1 имеет длинную 3′-НТО, расположенную в пределах одного экзона, т. е. после стоп-кодона ОРС отсутствуют места соединения экзонов (EJC). Таким образом, к eRF1 человека не применим механизм авторегуляции экспрессии за счет EJC-зависимого NMD.

3′-НТО мРНК eRF1 клонировали из клеточной линии HEK293 эмбриональной почки человека. Из клеток HEK293 была выделена тотальная мРНК (в трех биологических повторах), и на каждом из образцов синтезировали два вида кДНК с использованием олиго-dT или случайных праймеров. Из образцов кДНК, полученных с использованием олиго-dT и специфичного прямого праймера, синтезировались ПЦР-продукты длиной около 1600 п. н., которые клонировали в вектор. Секвенирование полученных последовательностей показало, что они соответствуют области между прямым праймером и сайтом полиаденилирования 1, т. е. укороченному фрагменту 3′-НТО (рис. 1а). При этом ПЦР-продукты большего размера не детектировались.

 

Рис. 1. Структура мРНК eRF1. а – Схема организации референсной мРНК eRF1 NM_004730. Стрелками отмечены праймеры, использованные для получения 3′-НТО мРНК eRF1. б – Схема организации 5′-НТО eRF1 и частота использования сайтов старта транскрипции согласно базе DBTSS. Зелеными и красными прямоугольниками отмечены старт- и стоп-кодоны соответственно. Цифра внутри прямоугольников означает рамку считывания относительно основной ОРС. Цифра рядом с зелеными квадратами означает порядковый номер AUG относительно старт-кодона основной ОРС, принятый за 0. Светло-зеленым цветом выделена последовательность регуляторного элемента TISU. Серым обозначена укороченная последовательность 5′-НТО eRF1, изучаемая в работе, наряду с полноразмерной.

 

Затем из каждого полученного варианта кДНК мы попытались синтезировать ПЦР-продукты с прямым специфичным праймером и одним из обратных праймеров на 3′-НТО мРНК eRF1 (3′R1–5). При этом во всех случаях ПЦР-продукты получались только с обратными праймерами 3′R4–5 (рис. 1а). Секвенирование этих ПЦР-продуктов показало, что они соответствуют ранее клонированному укороченному 3′-НТО. Таким образом, в HEK293 преимущественно присутствует укороченный вариант 3′-НТО мРНК eRF1, который в дальнейшем использовали в экспериментах.

5′-НТО мРНК eRF1 содержит дополнительные старт- и стоп-кодоны в различных рамках считывания (рис. 1б). Интересно, что вторые старт- (–2) и стоп-кодоны организуют минимальную кОРС (AUGUGA), расположенную в другой рамке считывания относительно основной ОРС. При этом, третьи старт- и стоп-кодоны образуют еще одну кОРС (далее также 5′ОРС) в одной рамке с основной ОРС. Подробные данные о стартах транскрипции NM_004730 (и размерах 5′-НТО) доступны в базе данных DBTSS (Data Base Transcriptional Start Sites, https://dbtss.hgc.jp) [37]. Согласно этим данным, полноразмерный 5′-НТО eRF1 в HEK293 (и других доступных в базе образцах) синтезируется крайне редко, а старты транскрипции располагаются в широком диапазоне, преимущественно перед и после дополнительных старт-кодонов (рис. 1б). Нами получена полноразмерная 5′-НТО eRF1 (далее – “вся 5′-НТО” eRF1), а также укороченная, чаще транскрибируемая, версия 5′-НТО eRF1 (далее – “5′-НТО” eRF1), не включающая два первых дополнительных старт- и стоп-кодона (рис. 1б). Таким образом, мРНК eRF1 в клетках чаще всего укорочена с 5′- и 3′-концов относительно референсной последовательности, а размер ее 5′-НТО варьирует в широких пределах.

Длина 5′-НТО eRF1 влияет на эффективность трансляции и сквозного прочтения. eRF1 не влияет на собственную трансляцию

Для изучения влияния 5′-НТО eRF1 и белка eRF1 на трансляцию и сквозное прочтение стоп-кодонов мы создали ряд конструкций с репортером Nluc (рис. 2б). В данных конструкциях Nluc была лишена собственного старт-кодона. В конструкциях 5′_Nl (1–3) репортер Nluc детектировал трансляцию кОРС 5′-НТО eRF1 (5′-ОРС). Для изучения сквозного прочтения были созданы соответствующие контрольные конструкции, в которых стоп-кодон UAG быд заменен кодоном UCG, кодирующим серин. 5′_Nl (1) содержала всю 5′-НТО eRF1 из референсной последовательности NM_004730, а 5′_Nl (2) – укороченный вариант (отмечен серым на рис. 1б). 5′_Nl (3) содержала гибридную 5′-НТО, в которой непосредственно перед 5′-ОРС расположена последовательность 5′-НТО β-глобина (HBB), не содержащая дополнительных старт- и стоп-кодонов. ОРС_Nl перед репортером содержит 5′-НТО HBB с последующими полной ОРС eRF1 и 9-нуклеотидным натуральным 3′-контекстом ее стоп-кодона.

Для оценки сквозного прочтения на разных стоп-кодонах созданы независимые конструкции, общая схема которых представлена на рис. 1а. В этих конструкциях перед ОРС Nluc расположены 5′-НТО и первые 13 кодонов ОРС HBB с последующим стоп-/смысловым кодоном (UAA/AAA, UAG/UAU, UGA/UGU) и соответствующим 6-нуклеотидным 3′-контекстом (GGGCUG, GAUAAU, CUAGUA) для усиления сквозного прочтения [35].

Изучение сквозного прочтения стоп-кодона UAG 5′-ОРС показывает, что на него влияет предшествующая последовательность: максимальная эффективность сквозного прочтения наблюдается на укороченной 5′-НТО eRF1 (более распространенной в клетке), чуть хуже прочитывается стоп-кодон с полноразмерной 5′-НТО eRF1 и хуже всего происходит сквозное прочтение стоп-кодона с 5′-НТО HBB (рис. 2в).

 

 

Рис. 2. Влияние на сквозное прочтение и трансляцию 5′-НТО и ОРС eRF1, а также избытка eRF1. а – Общая схема конструкций с преждевременными стоп-кодонами перед ОРС нанолюциферазы. Конструкция включает 5′-НТО и первые 13 кодонов ОРС мРНК β-глобина с последующим стоп-/смысловым кодоном (UAA/AAA, UAG/UAU, UGA/UGU) и соответствующим 6-нуклеотидным 3′-контекстом (GGGCUG, GAUAAU, CUAGUA) для усиления сквозного прочтения, за которыми следует ОРС Nluc без собственного старт-кодона в той же рамке считывания. 3′-НТО является искусственной и продуцируется из ~170 нуклеотидов после стоп-кодона в ОРС Nluc в исходной плазмиде. б – Схема модельных конструкций для изучения сквозного прочтения стоп-кодонов мРНК eRF1. в – Измеренный в бесклеточных системах трансляции уровень сквозного прочтения модельных мРНК с репортером, содержащим нанолюциферазу. г – Влияние избытков eRF1 на сквозное прочтение стоп-кодонов в моделях с 5′-НТО и ОРС собственной мРНК. д – Влияние длины 5′-НТО eRF1 на трансляцию. Сравниваемые матрицы имеют идентичные последовательности после старта трансляции и отличаются только длиной 5′-НТО. О.Е.Л. – относительные единицы люминесценции, н. д. – различия не достоверны.

 

При этом сквозное прочтение UAG 5′-ОРС в присутствии 5′-НТО eRF1 выше, чем в модельной конструкции с преждевременным стоп-кодоном (ПСК) UAG_Nl, однако 5′-НТО HBB снижает эффективность сквозного прочтения. Сквозное прочтение UAG ОРС eRF1 не отличается от сквозного прочтения ПСК UAG_Nl. Отсутствие повышенного сквозного прочтения основной ОРС eRF1 является дополнительным доводом против возможности описанной у растений и грибов авторегуляции трансляции eRF1 посредством NMD. Более того, добавление избытков eRF1 не влияет на сквозное прочтение стоп-кодонов в 5′-ОРС и основной ОРС eRF1 и на трансляцию соответствующих конструкций (рис. 2г, д). Эти данные противоречат возможности авторегуляции трансляции eRF1. Эффективность трансляции в присутствии полноразмерной 5′-НТО eRF1 ниже, чем в присутствии укороченной, что обусловлено, вероятнее всего, большим количеством дополнительных старт-кодонов (рис. 2д).

5′-НТО и 3′-НТО eRF1 обеспечивают эффективную трансляцию основной рамки считывания

Для изучения влияния 5′- и 3′-НТО eRF1 на трансляцию фактора терминации созданы модельные мРНК на основе репортера Fluc (рис. 3а). В отличие от небольшой ОРС Nluc, ОРС Fluc имеет схожие с ОРС eRF1 длину и GC-состав. В качестве контроля использовали 5′-НТО HBB и 3′-НТО GAPDH. Соответствующие белки представлены в клетках в высоких концентрациях, и НТО их мРНК должны способствовать эффективной трансляции. In vitro в лизате клеток HEK293 5′-НТО eRF1 увеличивает эффективность трансляции даже относительно 5′-НТО HBB, в то время как 3′-НТО eRF1 не улучшает трансляцию репортера Fluc (рис. 3б). 5′- и 3′-НТО eRF1 совместно обеспечивают максимальный уровень трансляции репортера.

 

Рис. 3. Влияние 5′-НТО и 3′-НТО мРНК eRF1 на трансляцию. а – Схема конструкций, кодирующих люциферазу светлячка, использованных в экспериментах. б – Влияние 5′- и 3′-НТО мРНК eRF1 на трансляцию Fluc в лизате HEK293. в – Влияние 5′- и 3′-НТО мРНК eRF1 на трансляцию Fluc в культуре клеток HEK293.

 

Этот же эксперимент мы повторили in vivo в клетках HEK293, трансфицировав их теми же мРНК в соответствии с методом FLERT (Fleeting mRNA Transfection technique) [38]. In vivo 5′- и 3′-НТО eRF1 совместно достоверно улучшают трансляцию репортера Fluc, в то время как одна 3′-НТО eRF1 не влияет заметно на трансляцию (рис. 3в). Таким образом, 5′-НТО eRF1 сильнее всего влияет на трансляцию фактора терминации, тогда как эффект 3′-НТО eRF1 зависит от наличия 5′-НТО eRF1.

Cтарт-кодон 5′-НТО eRF1 ингибирует трансляцию

Влияние дополнительных старт- и стоп-кодонов, образующих кОРС в 5′-НТО eRF1, на трансляцию основной ОРС мы изучали с использованием созданных нами вариантов мРНК ОРС Fluc c 5′- и 3-НТО eRF1, в которых заменяли старт- и/или стоп-кодон на смысловой кодон (AAG и UCG соответственно). Эти конструкции использовали в экспериментах in vivo в культуре клеток HEK293 с помощью метода FLERT [38].

 

Рис. 4. Влияние старт- и стоп-кодонов в кОРС 5′-НТО мРНК eRF1. а – Общая схема конструкций, представляющая четыре варианта мРНК: “ДТ” – дикий тип 5′-НТО eRF1 не изменена и содержит старт- и стоп-кодон кОРС, “-старт в 5′-НТО” – старт-кодон кОРС заменен на кодон AAG, “-стоп в 5′-НТО” – стоп-кодон кОРС заменен на UCG, “-старт и стоп в 5′-НТО” – старт-кодон кОРС заменен на кодон AAG, а стоп-кодон – на UCG. б – Эффективность трансляции in vivo в клетках HEK293 репортерной мРНК с мутациями старт- и стоп-кодона кОРС 5′-НТО из мРНК eRF1.

 

Удаление альтернативного старт-кодона из 5′-НТО eRF1 привело к более чем двукратному увеличению эффективности трансляции репортера, в то время как удаление стоп-кодона в 5′-НТО eRF1 практически не повлияло на трансляцию (рис. 4). Таким образом, наиболее заметным регулятором трансляции в мРНК eRF1 является старт-кодон кОРС в 5′-НТО eRF1.

Механизм регуляции трансляции мРНК eRF1 некодирующими областями

Полученные нами данные показывают, что наибольшее влияние на трансляцию оказывает 5′-НТО eRF1, а также ее сочетание с 3′-НТО eRF1, которые стимулируют трансляцию основной ОРС. При этом старт-кодон кОРС в 5′-НТО eRF1 ингибирует трансляцию, так как его удаление дополнительно увеличивает эффективность трансляции более чем в 2 раза, что в целом соответствует представлениям о регуляции трансляции кОРС [39–42]. Мы предполагаем, что трансляция eRF1 регулируется на двух уровнях: на уровне транскрипции и на уровне трансляции. Как видно из рис. 1б, мРНК eRF1 гетерогенна, имеет лидерные участки разной длины, при этом множественные сайты старта транскрипции концентрируются в области дополнительных старт-кодонов в 5′-НТО. Таким образом, за счет регуляции транскрипции может продуцироваться мРНК eRF1 с различным количеством дополнительных старт-кодонов и кОРС. В свою очередь, дополнительные старт-кодоны и кОРС регулируют трансляцию по известным механизмам, ингибируя трансляцию основной ОРС за счет “захвата” факторов инициации трансляции. Таким образом, наибольшую эффективность трансляции eRF1 должны обеспечивать транскрипционные варианты мРНК с короткой 5′-НТО, не включающие дополнительные старт-кодоны. Следует отметить, что регуляция трансляции основной ОРС посредством кОРС активно изучается на других объектах, и полученные нами данные соответствуют общепринятому мнению о том, что кОРС подавляют трансляцию основной ОРС [39–42]. Кроме того, в ряде работ поднимается вопрос о регуляции трансляции за счет гетерогенности старта транскрипции некоторых мРНК, приводящей к возникновению в них набора 5′-НТО различной длины [43–45], что соответствует нашим выводам о транскрипции eRF1.

Также мы заметили, что старт-кодон основной ОРС eRF1 входит в состав трансляционно-транскрипционного регуляторного элемента TISU (Translation Initiator of Short 5′UTR). Ранее считалось, что трансляция первого старт-кодона мРНК, имеющей слишком короткую 5′-НТО, происходит неэффективно, с “утечкой” старта трансляции на следующий AUG [46]. Однако позднее был описан регуляторный элемент TISU, способствующий эффективной трансляции с первого старт-кодона в матрицах мРНК, имеющих короткую 5′-НТО [47]. Локализация TISU частично перекрывается с последовательностью Козак. Кроме того, TISU описан как цис-регулятор транскрипции, способный связываться с транскрипционным фактором YY1 (Yin Yang 1 – Инь Ян 1) и эффективно стимулировать синтез мРНК с промоторов генов, имеющих высокую гетерогенность сайтов старта транскрипции [47]. Наличие TISU и его положение в мРНК eRF1 согласуются с нашей гипотезой о двухуровневой транскрипционно-трансляционной регуляции трансляции eRF1.

В целом, можно заключить, что регуляция трансляции основной ОРС eRF1 человека принципиально отличается от регуляции трансляции мРНК eRF1 растений и грибов, у которых описано существование NMD-зависимого авторегуляторного контура экспрессии [31, 32]. Продукция фактора терминации eRF1 человека не зависит от его концентрации в клетке и регулируется собственными 5′- и 3′-НТО.

 

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (№ 22-24-01019)

Настоящая работа выполнена без использования людей или животных в качестве объектов исследования.

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.

Дополнительные материалы доступны на сайте: http://www.molecbio.ru/downloads/2024/4/supp_Shuvalov_rus.pdf.

×

Sobre autores

A. Shuvalov

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences; Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Autor responsável pela correspondência
Email: alkalaeva@eimb.ru
Rússia, Moscow, 119991; Moscow, 119991

A. Klishin

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences; Moscow Institute of Physics and Technology

Email: alkalaeva@eimb.ru
Rússia, Moscow, 119991; Moscow Region, Dolgoprudny, 141700

N. Biziaev

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: alkalaeva@eimb.ru
Rússia, Moscow, 119991

E. Shuvalova

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences; Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: alkalaeva@eimb.ru
Rússia, Moscow, 119991; Moscow, 119991

E. Alkalaeva

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences; Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences; Moscow Institute of Physics and Technology

Email: alkalaeva@eimb.ru
Rússia, Moscow, 119991; Moscow, 119991; Moscow Region, Dolgoprudny, 141700

Bibliografia

  1. Bertram G., Bell H.A., Ritchie D.W., Fullerton G., Stansfield I. (2000) Terminating eukaryote translation: domain 1 of release factor eRF1 functions in stop codon recognition. RNA. 6, 1236–1247.
  2. Frolova L., Seit-Nebi A., Kisselev L. (2002) Highly conserved NIKS tetrapeptide is functionally essential in eukaryotic translation termination factor eRF1. RNA. 8, 129–136.
  3. Bulygin K.N., Khairulina Y.S., Kolosov P.M., Ven'yaminova A.G., Graifer D.M., Vorobjev Y.N., Frolova L.Y., Kisselev L.L., Karpova G.G. (2010) Three distinct peptides from the N domain of translation termination factor eRF1 surround stop codon in the ribosome. RNA. 16, 1902–1914.
  4. Bulygin K.N., Khairulina Y.S., Kolosov P.M., Ven'yaminova A.G., Graifer D.M., Vorobjev Y.N., Frolova L.Y., Karpova G.G. (2011) Adenine and guanine recognition of stop codon is mediated by different N domain conformations of translation termination factor eRF1. Nucl. Acids Res. 39, 7134–7146.
  5. Kryuchkova P., Grishin A., Eliseev B., Karyagina A., Frolova L., Alkalaeva E. (2013) Two-step model of stop codon recognition by eukaryotic release factor eRF1. Nucl. Acids Res. 41, 4573–4586.
  6. Brown A., Shao S., Murray J., Hegde R.S., Ramakrishnan V. (2015) Structural basis for stop codon recognition in eukaryotes. Nature. 524, 493–496.
  7. Frolova L.Y., Tsivkovskii R.Y., Sivolobova G.F., Oparina N.Y., Serpinsky O.I., Blinov V.M., Tatkov S.I., Kisselev L.L. (1999) Mutations in the highly conserved GGQ motif of class 1 polypeptide release factors abolish ability of human eRF1 to trigger peptidyl-tRNA hydrolysis. RNA. 5, 1014–1020.
  8. Zhouravleva G., Frolova L., Le Goff X., Le Guellec R., Inge-Vechtomov S., Kisselev L., Philippe M. (1995) Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRF1 and eRF3. EMBO J. 14, 4065–4072.
  9. Frolova L., Le Goff X., Zhouravleva G., Davydova E., Philippe M., Kisselev L. (1996) Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRF1- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. RNA. 2, 334–341.
  10. Stansfield I., Jones K.M., Kushnirov V.V., Dagkesamanskayal A.R., Poznyakovski A., Paushkin S.V., Nierras C.R., Cox B.S., Ter-Avanesyan M.D., Tuite M.F. (1995) The products of the SUP45 (eRF1) and SUP35 genes interact to mediate translation termination in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 14, 4365–4373.
  11. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. (1997) Interaction between yeast Sup45p (eRF1) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion-dependent regulation. Mol. Cell. Biol. 17, 2798–2805.
  12. Ito K., Ebihara K., Nakamura Y. (1998) The stretch of C-terminal acidic amino acids of translational release factor eRF1 is a primary binding site for eRF3 of fission yeast. RNA. 4, S1355838298971874.
  13. Merkulova T.I., Frolova L.Y., Lazar M., Camonis J., Kisselev L.L. (1999) C-terminal domains of human translation termination factors eRF1 and eRF3 mediate their in vivo interaction. FEBS Lett. 443, 41–47.
  14. Namy O., Hatin I., Rousset J. (2001) Impact of the six nucleotides downstream of the stop codon on translation termination. EMBO Rep. 2, 787–793.
  15. Atkins J.F., Loughran G., Bhatt P.R., Firth A.E., Baranov P.V. (2016) Ribosomal frameshifting and transcriptional slippage: from genetic steganography and cryptography to adventitious use. Nucl. Acids Res. 44, 7007–7078
  16. Rodnina M.V., Korniy N., Klimova M., Karki P., Peng B. Z., Senyushkina T., Belardinelli R., Maracci C., Wohlgemuth I., Samatova E., Peske F. (2020) Translational recoding: canonical translation mechanisms reinterpreted. Nucl. Acids Res. 48, 1056–1067.
  17. Brogna S., Wen J. (2009) Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) mechanisms. Nat. Struct. Mol. Biol.16, 107–113.
  18. Шабельская С.В., Журавлева Г.А. (2010) Мутации в гене SUP35 нарушают процесс деградации мРНК, содержащих преждевременные стоп-кодоны. Молекуляр. биология. 44, 51–59.
  19. Schweingruber C., Rufener S.C., Zünd D., Yamashita A., Mühlemann O. (2013) Nonsense-mediated mRNA decay – Mechanisms of substrate mRNA recognition and degradation in mammalian cells. Biochim. Biophys. Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1829, 612–623.
  20. Karousis E.D., Gurzeler L.-A., Annibaldis G., Dreos R., Mühlemann O. (2020) Human NMD ensues independently of stable ribosome stalling. Nat. Commun. 11, 4134.
  21. Yang Q., Yu C.-H., Zhao F., Dang Y., Wu C., Xie P., Sachs M.S., Liu Y. (2019) eRF1 mediates codon usage effects on mRNA translation efficiency through premature termination at rare codons. Nucl. Acids Res. 47, 9243–9258.
  22. Wada M., Ito K. (2019) Misdecoding of rare CGA codon by translation termination factors, eRF1/eRF3, suggests novel class of ribosome rescue pathway in S. cerevisiae. FEBS J. 286, 788–802.
  23. Dever T.E., Ivanov I.P., Sachs M.S. (2020) Conserved upstream open reading frame nascent peptides that control translation. Annu. Rev. Genet. 54, 237–264.
  24. Bidou L., Allamand V., Rousset J.-P., Namy O. (2012) Sense from nonsense: therapies for premature stop codon diseases. Trends Mol. Med. 18, 679–688.
  25. Janzen D.M. (2004) The effect of eukaryotic release factor depletion on translation termination in human cell lines. Nucl. Acids Res. 32, 4491–4502.
  26. Freitag J., Ast J., Bölker M. (2012) Cryptic peroxisomal targeting via alternative splicing and stop codon read-through in fungi. Nature. 485, 522–525.
  27. Schueren F., Lingner T., George R., Hofhuis J., Dickel C., Gärtner J., Thoms S. (2014) Peroxisomal lactate dehydrogenase is generated by translational readthrough in mammals. ELife. 3, e03640
  28. Hofhuis J., Schueren F., Nötzel C., Lingner T., Gärtner J., Jahn O., Thoms S. (2016) The functional readthrough extension of malate dehydrogenase reveals a modification of the genetic code. Open Biol. 6, 160246.
  29. Svidritskiy E., Demo G., Korostelev A.A. (2018) Mechanism of premature translation termination on a sense codon. J. Biol. Chem. 293, 12472–12479.
  30. Dubourg C., Toutain B., Le Gall J.-Y., Le Treut A., Guenet L. (2003) Promoter analysis of the human translation termination factor 1 gene. Gene. 316, 91–101.
  31. Nyikó T., Auber A., Szabadkai L., Benkovics A., Auth M., Mérai Z., Kerényi Z., Dinnyés A., Nagy F., Silhavy D. (2017) Expression of the eRF1 translation termination factor is controlled by an autoregulatory circuit involving readthrough and nonsense-mediated decay in plants. Nucl. Acids Res. 45, 4174–4188.
  32. Kurilla A., Szőke A., Auber A., Káldi K., Silhavy D. (2020) Expression of the translation termination factor eRF1 is autoregulated by translational readthrough and 3'UTR intron‐mediated NMD in Neurospora crassa. FEBS Lett. 594, 3504–3517.
  33. Shuvalov A., Shuvalova E., Biziaev N., Sokolova E., Evmenov K., Pustogarov N., Arnautova A., Matrosova V., Egorova T., Alkalaeva E. (2021) Nsp1 of SARS-CoV-2 stimulates host translation termination. RNA Biol. 18, 804–817.
  34. СоколоваЕ.Е., Власов П.К., Егорова Т.В., Шувалов А.В., Алкалаева Е.З. (2020) Влияние А/G-состава 3'-контекстов стоп-кодонов на терминацию трансляции у эукариот. Молекуляр. биология. 54, 837–848.
  35. Biziaev N., Sokolova E., Yanvarev D.V., Toropygin I.Y., Shuvalov A., Egorova T., Alkalaeva E. (2022) Recognition of 3′ nucleotide context and stop codon readthrough are determined during mRNA translation elongation. J. Biol. Chem. 298, 102133.
  36. Holm S. (1979) A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scandinavian J. Statistics. 6, 65–70.
  37. Suzuki A., Kawano S., Mitsuyama T., Suyama M., Kanai Y., Shirahige K., Sasaki H., Tokunaga K., Tsuchihara K., Sugano S., Nakai K., Suzuki Y. (2018) DBTSS/DBKERO for integrated analysis of transcriptional regulation. Nucl. Acids Res. 46, D229–D238.
  38. Akulich K.A., Andreev D.E., Terenin I.M., Smirnova V.V., Anisimova A.S., Makeeva D.S., Arkhipova V.I., Stolboushkina E.A., Garber M.B., Prokofjeva M.M., Spirin P.V., Prassolov V.S., Shatsky I.N., Dmitriev S.E. (2016) Four translation initiation pathways employed by the leaderless mRNA in eukaryotes. Sci. Rep. 6, 37905.
  39. Lin Y., May G.E., Kready H., Nazzaro L., Mao M., Spealman P., Creeger Y., McManus C.J. (2019) Impacts of uORF codon identity and position on translation regulation. Nucl. Acids Res. 47, 9358–9367.
  40. Dever T.E., Ivanov I.P., Hinnebusch A.G. (2023) Translational regulation by uORFs and start codon selection stringency. Genes Dev. 37, 474–489.
  41. Starck S.R., Tsai J.C., Chen K., Shodiya M., Wang L., Yahiro K., Martins-Green M., Shastri N., Walter P. (2016) Translation from the 5′ untranslated region shapes the integrated stress response. Science. 351, aad3867
  42. Akulich K.A., Sinitcyn P.G., Makeeva D.S., Andreev D.E., Terenin I.M., Anisimova A.S., Shatsky I.N., Dmitriev S.E. (2019) A novel uORF-based regulatory mechanism controls translation of the human MDM2 and eIF2D mRNAs during stress. Biochimie. 157, 92–101.
  43. Dieudonné F.-X., O'Connor P.B.F., Gubler-Jaquier P., Yasrebi H., Conne B., Nikolaev S., Antonarakis S., Baranov P.V., Curran J. (2015) The effect of heterogeneous transcription start sites (TSS) on the translatome: implications for the mammalian cellular phenotype. BMC Genomics. 16, 986.
  44. Wang X., Hou J., Quedenau C., Chen W. (2016) Pervasive isoform‐specific translational regulation via alternative transcription start sites in mammals. Mol. Systems Biol. 12, 875
  45. Li H., Bai L., Li H., Li X., Kang Y., Zhang N., Sun J., Shao Z. (2019) Selective translational usage of TSS and core promoters revealed by translatome sequencing. BMC Genomics. 20, 282.
  46. Kozak M. (1991) A short leader sequence impairs the fidelity of initiation by eukaryotic ribosomes. Gene Expression. 1, 111–115.
  47. Elfakess R., Dikstein R. (2008) A translation initiation element specific to mRNAs with very short 5′UTR that also regulates transcription. PLoS One. 3, e3094.

Arquivos suplementares

Arquivos suplementares
Ação
1. JATS XML
Baixar
2. Appendix Table S1
Baixar (296KB)
Metadados
3. Fig. 1. The structure of eRF1 mRNA. a – Schematic diagram of the organization of the reference eRF1 mRNA NM_004730. The arrows indicate the primers used to obtain the 3'-UTR of eRF1 mRNA. b – Schematic diagram of the organization of the 5'-UTR of eRF1 and the frequency of transcription start site usage according to the DBTSS database. The start and stop codons are marked with green and red rectangles, respectively. The number inside the rectangles indicates the reading frame relative to the main ORF. The number next to the green squares indicates the AUG sequence number relative to the start codon of the main ORF, taken as 0. The sequence of the TISU regulatory element is highlighted in light green. The truncated sequence of the 5'-UTR of eRF1, studied in this work, is shown in gray, along with the full-length one.

Baixar (381KB)
Metadados
4. Fig. 2. Effect of 5' UTR and eRF1 ORF, as well as excess eRF1, on read-through and translation. a – General scheme of constructs with premature stop codons upstream of nanoluciferase ORF. The construct includes 5' UTR and first 13 codons of β-globin mRNA ORF followed by stop/sense codon (UAA/AAA, UAG/UAU, UGA/UGU) and corresponding 6-nucleotide 3' context (GGGCUG, GAUAAU, CUAGUA) to enhance read-through, followed by Nluc ORF without its own start codon in the same reading frame. 3' UTR is artificial and is produced from ~170 nucleotides after the stop codon in Nluc ORF in the original plasmid. b – Schematic diagram of model constructs for studying read-through of eRF1 mRNA stop codons. c – Level of read-through of model mRNAs with a reporter containing nanoluciferase measured in cell-free translation systems. d – Effect of excess eRF1 on read-through of stop codons in models with 5'-UTR and ORF of native mRNA. d – Effect of eRF1 5'-UTR length on translation. The compared templates have identical sequences after the start of translation and differ only in the length of 5'-UTR. Relative luminescence units, n.a. – differences are not significant.

Baixar (360KB)
Metadados
5. Fig. 3. Effect of 5′-UTR and 3′-UTR of eRF1 mRNA on translation. a – Schematic of constructs encoding firefly luciferase used in the experiments. b – Effect of 5′- and 3′-UTR of eRF1 mRNA on Fluc translation in HEK293 lysate. c – Effect of 5′- and 3′-UTR of eRF1 mRNA on Fluc translation in HEK293 cell culture.

Baixar (305KB)
Metadados
6. Fig. 4. Effect of start and stop codons in the sORF 5′-UTR of eRF1 mRNA. a – General scheme of the constructs representing four mRNA variants: “WT” – wild type, eRF1 5′-UTR is unchanged and contains the start and stop codon of the sORF, “-start in 5′-UTR” – the start codon of the sORF is replaced by the codon AAG, “-stop in 5′-UTR” – the stop codon of the sORF is replaced by UCG, “-start and stop in 5′-UTR” – the start codon of the sORF is replaced by the codon AAG, and the stop codon is replaced by UCG. b – Efficiency of in vivo translation in HEK293 cells of reporter mRNA with mutations in the start and stop codon of the sORF 5′-UTR from eRF1 mRNA.

Baixar (158KB)
Metadados

Declaração de direitos autorais © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».