Toll-like receptor gene polymorphisms in a population-based study of HIV and tuberculosis patients from Eastern Europe and Central Asia

Толық мәтін

Лавинообразное накопление результатов ассоциативных исследований, подтверждающих или опровергающих наличие связей полиморфных вариантов генов с заболеваниями абсолютно разной этиологии на выборках из разных стран и этнических групп, диктует необходимость валидации найденных ассоциаций на независимых выборках, поскольку на распределение аллелей риска могут влиять факторы, не учтенные в исходном исследовании. Одними из таких факторов являются межпопуляционные различия. В исследованиях предрасположенности к инфекционным заболеваниям у носителей разных аллелей полиморфных генов иммунной системы, в частности генов Толл-подобных рецепторов (TLR), часто наблюдается невозможность воспроизвести полученные результаты на независимых выборках. Толл-подобные рецепторы – рецепторы адаптивного иммунитета, расположенные на поверхности и внутри клеток, отвечают за распознавание патогенов, проникающих в организм.

Нами проведен анализ научных публикаций и отобрано шесть наиболее часто упоминаемых однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в генах TLR: rs5743551 (TLR1), rs5743708 (TLR2), rs3804100 (TLR2), rs4986790 (TLR4), rs5743810 (TLR6), rs3764880 (TLR8), для которых показана ассоциация с риском развития серьезных инфекционных патологий, включая туберкулез и ВИЧ [1]. rs5743551-A TLR1 в иранской популяции ассоциирован с риском возникновения туберкулеза легких [2], однако для этого же полиморфизма в популяции, проживающей на территории США (штат Вашингтон), повышенная восприимчивость к возникновению осложнений на фоне инфекционных заболеваний выявлена у носителей rs5743551-G TLR1 [3]. По результатам мета анализа генотип rs3804100-C/C TLR2 связан с повышенным риском развития туберкулеза [4]. В другом исследовании получены доказательства непосредственного влияния полиморфизма TLR2 rs5743708-A на риск развития сепсиса, особенно у лиц европейского происхождения [5]. Анализ TLR2 rs5743708 в подгруппах из разных популяций выявил, что аллель А ассоциирован с повышенной восприимчивостью к туберкулезу в азиатской этнической группе, но имеет протективный характер в группе латинского происхождения [4]. Полиморфизм rs4986790-G TLR4 ассоциирован с риском развития активного туберкулеза у ВИЧ-инфицированных пациентов в Танзании и Испании, несмотря на то что у больных туберкулезом, не инфицированных ВИЧ, связь не подтверждается [6, 7]. rs5743810-T TLR6 оказывает протективный эффект к развитию туберкулеза во всех этнических группах [4]. В ряде исследований показана ассоциация SNP в локусе rs3764880 TLR8 с туберкулезом у жителей Индонезии, России, Молдавии, Турции и в двух индийских когортах как для легочного, так и для внелегочного туберкулеза [8–13]. Аллель rs3764880-G TLR8 связан с восприимчивостью к туберкулезу и бактериальной нагрузкой среди жителей Пакистана, генотип rs3804100-C/C TLR2 – с восприимчивостью к латентной туберкулезной инфекции в китайской популяции, SNP в локусе rs4986790 TLR4 – к легочному туберкулезу у жителей Ирана [14, 15].

Большая часть исследований генетической предрасположенности проводится внутри определенных этнических или национальных групп, что связано с необходимостью учитывать различия в частотах аллелей, характерные для них. В этой связи исследование генетического разнообразия популяций человека, в том числе малоизученных, и особенно исследование полиморфных генов иммунной системы представляются актуальными и необходимыми для проведения в дальнейшем эпидемиологических и медико-биологических исследований.

Цель работы – определить популяционные особенности распространенности шести полиморфных вариантов генов TLR (rs5743551 TLR1, rs5743708 TLR2, rs3804100 TLR2, rs4986790 TLR4, rs5743810 TLR6, rs3764880 TLR8) среди пациентов с ВИЧ и туберкулезом в странах Восточной Европы и Центральной Азии.

Материалы и методы

Исследуемые выборки

В исследовании использовались образцы биологического материала (цельная кровь), полученные на территории Российской Федерации, Республики Беларусь, Республики Киргизия, Республики Армения и Республики Таджикистан. В качестве целевой группы были отобраны пациенты с диагнозами ВИЧ-инфекция и туберкулез (ТБ), не имеющие родственных связей. Критериями включения в исследование были: 1) для группы ВИЧ-положительных пациентов – диагноз ВИЧ-инфекции, подтвержденный иммуноферментным анализом и иммуноблоттингом; 2) для группы ТБ и ВИЧ/ТБ – диагноз туберкулез, подтвержденный обнаружением Mycobacterium tuberculosis в биологическом материале. Принадлежность индивида к этнической группе основывалась на самоопределении.

Для проведения сравнительного анализа нами были использованы данные из базы проекта “1000 Геномов” (The 1000 Genomes Project Phase 3) [16] по частотам полиморфных локусов в объединенных выборках европеоидов (EUR, n = 503), жителей стран Южной (SAS, n = 489) и Восточной (EAS, n = 504) Азии. В базе данных отсутствует информация о наличии у индивидов каких-либо заболеваний, поэтому этот фактор не учитывался как значимо влияющий на популяционные частоты.

Выбор и генотипирование SNP

На основе анализа опубликованных результатов научных исследований выбраны наиболее часто изучаемые SNP в генах TLR, ассоциированные с туберкулезом и ВИЧ-инфекцией, и проверены на неравновесие по сцеплению с использованием калькулятора LDlink Tool [17]. Для генотипирования исследуемых выборок использовались образцы периферической венозной крови, антикоагулированные ЭДТА. Геномную ДНК выделяли с помощью набора РИБОпреп (АмплиСенс, Россия) в соответствии с протоколом производителя. Генотипирование образцов проводили методом ПЦР в режиме реального времени c использованием референсных последовательностей из базы данных SNP [18] разработаны и апробированы методики для определения аллелей в исследуемых локусах [19].

Статистическая обработка данных

Статистический анализ проводили с использованием среды R (версия 4.3.1), включающей встроенные функции для анализа таблиц сопряженности (χ²-тест Пирсона и точный тест Фишера) и межгрупповых различий (тест Стьюдента). Генетические характеристики выборок анализировали с помощью пакетов Hardy–Weinberg [20], poppr [21–23], adegenet [24]. Для введения поправки на множественные сравнения использовали метод Бонферрони. Результаты считались статистически значимыми при p < 0.05. Информативность локусов оценивали, рассчитывая показатель PIC (информационное содержание полиморфизма) [25].

 

Таблица 1. Характеристики выборок из стран ВЕЦА.

Страна	SLV	ARM	KGZ	TJK
Структура выборок
Российская Федерация	124	2	–	–
Республика Беларусь	147	1	–	–
Республика Армения	1	134	–	–
Республика Киргизия	35	–	97	1
Республика Таджикистан	1	–	-	137
Итого	308	137	97	138
Характеристика выборок
Пол, м/ж	203/105	107/30	67/30	109/29
Возраст, лет, среднее (SD)	41.7 (8.1)	44.9 (11.3)	44.3 (10.3)	41.8 (10.0)

 

Результаты

Характеристика выборок

Выборки населения стран Восточной Европы и Центральной Азии (ВЕЦА) были гетерогенны по национальному составу, в связи с чем были перераспределены на группы в зависимости от этнической принадлежности: восточнославянскую (обозначена по преобладающим этносам SLV, n = 308), включающую русских (n = 162), белорусов (n = 140), украинцев (n = 4), литовцев (n = 1) и поляков (n = 1); армянскую (ARM, армяне, n = 137), киргизскую (KGZ, киргизы, n = 97) и таджикскую (TJK, таджики, n = 138). Структура и демографические характеристики сформированных выборок приведены в табл. 1. Во всех выборках наблюдается преобладание мужчин (SLV и KGZ – в 2 раза; ARM и TJK – более чем в 3.5 раза). Однако попарное сравнение выборок обнаруживает статистически значимые различия по соотношению мужчин/женщин только между выборками SLV и TJK (p_bonferroni = 0.03). Однако статистически значимых различий по частотам аллелей между мужчинами и женщинами по анализируемым локусам не обнаружено ни в одной из выборок. Средний возраст статистически значимо различался между выборками SLV и ARM (p_bonferroni = 0.02).

Проведено сравнение частот аллелей в исследуемых группах и популяционных частот EUR, EAS и SAS (табл. 2). Распределение генотипов в популяциях в большинстве случаев соответствовало равновесию Харди–Вайнберга (РХВ). Статистически значимое отклонение наблюдается только в выборке TJK по полиморфным локусам rs3804100 TLR2 и rs3764880 TLR8. При этом отклонение от РХВ локуса rs3764880 TLR8 в выборке TJK связано с тем, что он локализуется на X-хромосоме, а в данной выборке наблюдается значительное превышение числа мужчин над женщинами. Для ряда локусов частота аллелей в анализируемых выборках не отличалась значимо от частот в географически близких выборках из базы 1000 Genomes. Так, выборка SLV не отличалась от популяции EUR по частотам локусов rs5743708 TLR2, rs3804100 TLR2 и rs3764880 TLR8 (p > 0.05) и значимо отличалась от EAS и SAS (p < 0.01). Также по ряду локусов выборки ARM, KGZ и TJK характеризовались сходными частотами с популяциями EAS и SAS, но в то же время по другим локусам (rs5743708 TLR2, rs4986790 TLR4) не отличались по частотам аллелей от EUR. Для выборок из стран Центральной Азии характерно, что частоты локусов rs5743551 TLR1, rs3804100 TLR2, rs3764880 TLR8 в них оказались ближе к SAS, чем к EAS. Для полиморфного варианта rs5743810 TLR6 распределение аллелей во всех выборках оказалось уникальным и значимо (p < 0.001) отличалось от популяций из базы 1000 Genomes.

Сравнение выборок из стран ВЕЦА между собой показало, что для полиморфных вариантов гена TLR2 (rs5743708, rs3804100) не характерна популяционная специфичность, и наоборот для rs5743810 TLR6 обнаружены значимые различия (p < 0.05) в частотах генотипов при сравнении выборок SLV/ARM, SLV/KGZ, SLV/TJK, ARM/KGZ и ARM/TJK (рис. 1). При этом имеющие сходные частоты генотипов rs5743810 TLR6 выборки KGZ и TJK значимо различались при сравнении частот генотипов rs5743551 TLR1 и аллелей rs3764880 TLR8. Последнее, впрочем, может быть объяснено тем, что в выборке TJK женщин в 3.76 раз меньше чем мужчин, а в выборке KGZ это соотношение составляет 2.23. Для восточнославянской выборки SLV обнаружены наибольшие отличия от остальных выборок по частотам генотипов rs5743551 TLR1, rs4986790 TLR4, rs5743810 TLR6.

 

Таблица 2. Сравнительная характеристика SNP в локусах rs5743551 (TLR1), rs5743708 (TLR2), rs3804100 (TLR2), rs4986790(TLR4), rs5743810 (TLR6), rs3764880 (TLR8) в выборках стран ВЕЦА и популяциях EUR, EAS и SAS базы данных 1000 Genomes

rs-номер в базе данных NCBI (ген)	Выборки стран ВЕЦА	Аллель (٪)	HWE, p*	Выборки из базы данных 1000 Genomes
				EUR		EAS		SAS
				аллель (٪)	p***	аллель (٪)	p	аллель (٪)	p
rs5743551 (TLR1)	SLV	G (18.7)	0.06	G (28.5)	<0.001	A (39.8)	<0.001	G (48.3)	<0.001
	ARM	G (45.3)	1.00		<0.001		<0.001		0.412
	KGZ	A (44.8)	1.00		<0.001		0.202		0.168
	TJK	G (45.7)	0.30		<0.001		<0.001		0.454
rs5743708 (TLR2)	SLV	A (4.06)	0.08	A (2.4)	0.072	A (0.1)	<0.001	A (0.1)	<0.001
	ARM	A (2.55)	1.00		0.826		<0.001		<0.001
	KGZ	A (2.06)	1.00		1.000		0.009		0.009
	TJK	A (0.72)	1.00		0.281		0.281		0.281
rs3804100 (TLR2)	SLV	C (8.60)	0.48	C (6.4)	0.090	C (23.9)	<0.001	C (13.7)	0.005
	ARM	C (10.6)	0.36		0.050		<0.001		0.200
	KGZ	C (15.5)	0.46		<0.001		0.022		0.500
	TJK	C (14.1)	0.03		<0.001		<0.001		0.800
rs4986790 (TLR4)	SLV	G (9.09)	0.15	G (5.7)	0.023	G (0.0)	<0.001	G (12.6)	0.034
	ARM	G (1.46)	1.00		<0.001		<0.001		<0.001
	KGZ	G (2.06)	1.00		0.033		0.001		<0.001
	TJK	G (6.16)	0.08		0.771		<0.001		<0.001
rs5743810 (TLR6)	SLV	A (28.4)	0.78	A (40.9)	<0.001	A (0.0)	<0.001	A (1.7)	<0.001
	ARM	A (19.3)	0.78		<0.001		<0.001		<0.001
	KGZ	A (7.73)	0.44		<0.001		<0.001		<0.001
	TJK	A (10.9)	0.05		<0.001		<0.001		<0.001
rs3764880 (TLR8)	SLV	G (25.9)	0.58**	G (26.9)	0.730	A (19.2)	<0.001	A (41.9)	<0.001
	ARM	G (44.9)	0.40		<0.001		<0.001		0.002
	KGZ	A (52.8)	0.34		<0.001		<0.001		0.285
	TJK	G (37.1)	0.0017		0.011		<0.001		<0.001

 

Уровень генетического разнообразия исследуемых выборок оценивали по показателям H_Е (средняя ожидаемая гетерозиготность), H_O (средняя наблюдаемая гетерозиготность) и H_T (показатель общего генетического разнообразия) (табл. 3). Среднее значение наблюдаемой гетерозиготности по всем изученным локусам составило 0.21. Наименьший уровень этой гетерозиготности показан для локуса rs5743708 в выборке TJK – 0.0145. Наибольший вклад в межпопуляционное разнообразие (G_ST = 0.074) вносят различия в частотах аллелей rs5743551 TLR1, который единственный из анализируемых характеризуется высоким значением средней ожидаемой гетерозиготности (достигает 0.45). При этом выборки ARM, KGZ и TJK показывают наиболее высокое значение индекса среднего внутрипопуляционного разнообразия (>0.49). Для остальных полиморфных локусов характерны низкое генетическое разнообразие (0.014–0.407) во всех анализируемых выборках и незначительный вклад в межпопуляционное разнообразие (G_ST = 0.004–0.044). Рассчитанное по шести локусам SNP генетическое расстояние [26] между выборками составило 0.0064–0.1482. Выборка SLV – наиболее удаленная от остальных популяций, дистанция по Нею между этой популяцией и всеми остальными варьирует от 0.07 до 0.1482 (между SLV и KGZ). Значение показателя информативности PIC варьирует от 0.05 (низко информативный локус) до 0.35 (средняя информативность) и в среднем для шести локусов составляет 0.19 (±0.12).

 

Рис. 1. Распределение частот генотипов полиморфных вариантов генов TLR в исследуемых выборках: а – rs5743551 (TLR1), б – rs5743708 (TLR2), в – rs3804100 (TLR2), г – rs4986790 (TLR4), д – rs5743810 (TLR6), е – rs3764880 (TLR8).

 

Таблица 3. Характеристика внутри- и межпопуляционного разнообразия выборок стран ВЕЦА по полиморфным вариантам генов TLR

		SLV		ARM		KGZ
		HO	HЕ/HT	HO	HЕ/HT	HO	HЕ/HT
rs5743551 (TLR1)		0.2695	0.3042	0.4964	0.4973	0.5876	0.4968
rs5743708 (TLR2)		0.0682	0.0780	0.0511	0.0500	0.0412	0.0406
rs3804100 (TLR2)		0.1526	0.1575	0.2117	0.1899	0.2887	0.2627
rs4986790 (TLR4)		0.1818	0.1655	0.0292	0.0289	0.0412	0.0406
rs5743810 (TLR6)		0.3994	0.4074	0.3285	0.3131	0.1340	0.1435
Суммарно		0.2143	0.2225	0.2234	0.2158	0.2186	0.1968
	TJK			Суммарные показатели
	HO		HЕ/HT	HO	HЕ/HT	GST	PIC
rs5743551 (TLR1)	0.4493		0.4982	0.4507	0.4491/0.4848	0.0737	0.3505
rs5743708 (TLR2)	0.0145		0.0144	0.0438	0.0458/0.0459	0.0036	0.0528
rs3804100 (TLR2)	0.1957		0.2437	0.2121	0.2134/0.2144	0.0044	0.1779
rs4986790 (TLR4)	0.0942		0.1161	0.0866	0.0878/0.0895	0.0191	0.1057
rs5743810 (TLR6)	0.1594		0.1946	0.2553	0.2648/0.2770	0.0441	0.2694
Суммарно	0.1826		0.2134	0.2097	0.2122/0.2223	0.0457	–

Примечание. H_O – средняя наблюдаемая гетерозиготность; H_Е – показатель среднего внутрипопуляционного разнообразия; H_T – показатель общего генетического разнообразия; G_ST – показатель межпопуляционного разнообразия [26, 27]; PIC – информационное содержание полиморфизма (PIC, polymorphisminformationcontent).

 

Обсуждение

Наблюдаемые различия частот SNP генов TLR между анализируемыми выборками из стран ВЕЦА и популяциями EUR, EAS и SAS коррелируют с их этногеографическим положением. Белорусы вместе с украинцами и русскими представляют восточнославянскую языковую группу, крупнейшую как по численности, так и по территории, проживающую в Восточной Европе наряду с балтийскими, финно-пермскими и тюркоязычными народами [28]. Для восточнославянских популяций не характерна высокая изолированность. По результатам молекулярного дисперсионного анализа во всех группах наблюдается высокая диверсификация гаплотипов, но низкая межпопуляционная дисперсия [29]. Согласно результатам, полученным другими исследовательскими группами, генетические расстояния между восточнославянскими популяциями могут оказаться значительными [29]. В настоящем исследовании выборка SLV отличалась не только от KGZ, TJK и ARM, но и от EUR по локусам rs5743551 TLR1, rs4986790 TLR4, rs5743810 TLR6. Это можно рассматривать как следствие того, что на формирование генофонда восточнославянских популяций повлияли потоки генов между западом и востоком Евразии. В то же время выборка ARM показывает отличия как от центральноазиатских выборок KGZ и TJK (rs5743810 TLR6), так и от SLV и EUR (rs5743551 TLR1, rs4986790 TLR4, rs5743810 TLR6). Распределение гаплотипов и структура генетических расстояний свидетельствуют о высокой степени генетической изоляции в горных южных и восточных регионах Армении, в то время как в северных, центральных и западных регионах наблюдалось более значительное смешение с популяциями из соседних стран Ближнего Востока [30]. Расположенное на стыке Европы и Ближнего Востока, Армянское нагорье служило переходным коридором для крупных волн миграций [31]. Популяции, проживающие в Центральной Азии, так же, как и армянские популяции, находятся на месте большого количества торговых путей. Генетическая самобытность этих народностей может быть объяснена языковыми и культурными различиями, которые возникли относительно недавно и действуют как барьеры для потока генов между этническими группами с вероятно общей демографической историей [32]. Полученные нами результаты показывают различия между выборками KGZ и TJK и восточнославянской (SLV) по локусам rs5743551 TLR1 и rs5743810 TLR6, что согласуется с данными, полученными ранее с использованием других генетических маркеров, а в выборках TJK, KGZ (как и ARM) значение индекса среднего внутрипопуляционного разнообразия локуса rs5743551 TLR1 подтверждает, что в этих странах наблюдается уровень генетической вариабельности более характерный для азиатских популяций [33, 34]. Масштабное генотипирование этнических киргизов по 246544 сайтам аутосомных SNP и последующий анализ главных компонент (PCA) установили, что они образуют разреженный кластер, не пересекающийся ни с EAS, ни с SAS [33], что подтверждает высокий уровень миграции, характерный для Киргизстана, и соответствует полученным нами результатам по локусам rs5743708 TLR2, rs4986790 TLR4 и rs5743810 TLR6. Генетические исследования показали, что миграции из Восточной Азии способствовали распространению тюркско-монгольского населения (казахи, киргизы) в Центральной Азии и частичной замене индоиранского населения (таджики), существовавшего на этих территориях задолго до тюркско-монгольского [35]. Однако по данным Б. Мартинез-Круз и соавт. [36] в геноме таджиков содержание восточноазиатского (тюркско-монгольского) компонента остается низким.

В настоящем исследовании это находит подтверждение в значимых различиях частот аллелей и генотипов полиморфных генов TLR1 (rs5743551) и TLR8 (rs3764880) между выборками KGZ и TJK и в то же время в отсутствии различий по остальным генам TLR. По данным исследований, относительно недавний поток генов из популяций Южной Азии в Центральную Азию привел к генетическому сближению этих популяций [37]. Наблюдаемые различия в частотах аллелей генов TLR могут быть связаны не только с этническими и географическими особенностями выборок, но и с тем, что в выборку стран ВЕЦА включены не случайные популяционные образцы, а группы пациентов с тяжелыми инфекционными заболеваниями – ВИЧ-инфекция и туберкулез. Масштабный мета анализ показал, что полиморфные варианты TLR1 (rs4833095, rs5743557, rs5743596, rs5743618), TLR2 (rs3804099, rs5743704, rs5743708), TLR4 (rs4986790, rs4986791), TLR6 (rs5743810) и TLR8 (rs3764879) значимо ассоциированы с туберкулезом в определенных этнических группах [38]. Гетерогенность, наблюдаемая между исследованиями rs4506565 TLR1, rs4986790 TLR4, rs4986791 TLR4 и rs5743836 TLR9 в мета анализе, указывает на то, что распределение аллелей этих полиморфных генов значительно различается в разных популяциях. Поэтому генетические ассоциации между этими полиморфными вариантами генов TLR и риском развития туберкулеза могут быть этнически специфичными и не должны обобщаться на более широкую популяцию. Результаты исследования генетической предрасположенности, проведенные на выборке населения г. Москвы, установили, что аллель rs4986790-G TLR4 ассоциирован с повышенным риском развития туберкулеза у ВИЧ-инфицированных [39]. В то же время по результатам исследования проведенного на независимой выборке, этот аллель ассоциирован с протективным эффектом по отношению к риску туберкулеза у ВИЧ-инфицированных [19]. Наблюдаемые прямо противоположные результаты могут быть связаны как с тем, что в нашем исследовании [19] использовалась выборка иного этнического состава, чем в работе [39], так и со значительными различиями в размерах самих выборок между этими исследованиями. Несмотря на низкую информативность (значение показателя PIC 0.05–0.35) анализируемых полиморфных вариантов, обнаруженные различия в частотах аллелей риска могут не совпадать между выборками, что важно учитывать при проведении генетических и эпидемиологических исследований [40, 41].

Исследование не получало внешнего финансирования.

Исследование одобрено Этическим комитетом ФБУН “Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии”: дата 26.03.2019, номер протокола 90.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. Все обследованные – совершеннолетние.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Авторлар туралы

S. Salamaikina

Central Research Institute of Epidemiology Federal service for surveillance on consumer rights protection and human wellbeing; Moscow institute of physics and technology

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: salamaykina@cmd.su

национальный исследовательский университет

Ресей, Moscow, 111123; Dolgoprudny, 141701

V. Korchagin

Central Research Institute of Epidemiology Federal service for surveillance on consumer rights protection and human wellbeing

Email: salamaykina@cmd.su
Ресей, Moscow, 111123

К. Mironov

Central Research Institute of Epidemiology Federal service for surveillance on consumer rights protection and human wellbeing

Email: salamaykina@cmd.su
Ресей, Moscow, 111123

Е. Kulabukhova

Central Research Institute of Epidemiology Federal service for surveillance on consumer rights protection and human wellbeing; Peoplesʹ Friendship University of Russia (RUDN University)

Email: salamaykina@cmd.su
Ресей, Moscow, 111123; Moscow, 117198

V. Zimina

Kemerovo state medical university of the ministry of health of the Russian Federation

Email: salamaykina@cmd.su
Ресей, Kemerovo, 650056

А. Kravtchenko

Central Research Institute of Epidemiology Federal service for surveillance on consumer rights protection and human wellbeing

Email: salamaykina@cmd.su
Ресей, Moscow, 111123

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар