Activities and Kinetic Parameters of Carboxylesterases in Model Insects depending on a Substrate of the Enzyme

Texto integral

ВВЕДЕНИЕ

Устойчивость насекомых к инсектицидам остается широко распространенным явлением [1], снижая эффективность применения препаратов и порождая проблемы общественного здравоохранения и загрязнения окружающей среды [2, 3]. Важный аспект контроля численности устойчивых популяций насекомых заключается в изучении биохимических и молекулярных основ инсектицидной резистентности. В качестве модельного организма при тестировании инсектицидов и изучении механизмов формирования инсектицидной устойчивости часто используют синантропных насекомых, в частности лабораторные линии комнатной мухи Musca domestica L. (Diptera: Muscidae) [4]. К настоящему времени у природных популяций комнатной мухи описана устойчивость к инсектицидам широко используемых классов химических соединений (органофосфатам, карбаматам, пиретроидам, неоникотиноидам) [5].

Многие инсектициды содержат карбоксильные, фосфатные или карбаматноэфирные связи. Гидролитическое расщепление сложноэфирных связей ферментами насекомых является одним из основных механизмов детоксикации инсектицидов [6]. Ферменты, гидролизующие данные связи, относятся к эстеразам (EST, EC3.1) и представляют собой разнообразную группу с широкой и перекрывающейся субстратной специфичностью [6, 7]. Ярким представителем группы является семейство карбоксилэстераз, которые играют значительную роль в формировании и развитии инсектицидной резистентности [8]. Карбоксилэстеразы (CarE, EC3.1.1.1) – суперсемейство сериновых гидролаз, катализирующих гидролиз сложных эфиров карбоновых кислот на соответствующие спирты и карбоновые кислоты [9–11]. CarE участвуют в метаболической детоксикации эндогенных соединений (метаболизм липидов, деградация нейромедиаторов, метаболизм специфических гормонов, феромонов [10] и экзогенных токсичных веществ [12]). Было показано, что CarE играют ключевую роль в защите насекомых от ксенобиотиков, в том числе и пестицидов, таких как пиретроиды [12, 13], карбаматы, фосфорорганические соединения [6, 9–12], рианоиды [2]. Повышенная активность CarE часто связана с устойчивостью насекомых к пестицидам, что было подтверждено у комаров (Culex tarsalis, Culex pipiens quinquefasciatus, Aphis gossypii), мух (Lucilia cuprina, M. domestica), хлопковой совки (Helicoverpa armigera), маленького коричневого плантхоппера (Laodelphax striatellus), габробракона притупленного (Habrobracon hebetor), малого мучного хрущака (Tribolium confusum) [10, 11]. Вместе с тем, описано снижение активности фермента, либо разнонаправленные ее изменения у некоторых видов насекомых (в том числе у M. domestica), устойчивых к отдельным инсектицидам или подверженных их действию [14–16].

Измерение общей эстеразной активности и активности разных изоформ эстераз осуществляется по скорости гидролиза специфических субстратов. Широко используемыми субстратами являются нафтил ацетаты (α-NA, β-NA), нитрофенил ацетат (ρ-NPA) (рис. 1) [6, 17], 1-нафтил бутират (α-NB) [18], 4-нитрофенил бутират (ρ-NPB) и др. [19]. Из литературных данных следует, что субстратная специфичность карбоксилэстераз насекомых может различаться. Например, у белополосового шелкопряда (Dendrolimus superans) при исследовании цельного (неочищенного) гомогената и очищенной CarE наблюдали большее сродство фермента к β-NA, чем к α-NA [10]. И, напротив, очищенная рекомбинантная CarE хлопкового червеца (Helicoverpa armigera) проявляла более высокую эстеразную активность в отношении α-NA по сравнению с β-NA [11]. У самцов 2-х близкородственных видов муравьев (Solenopsis invicta, S. richteri) отмечена аналогичная ситуация (более высокая скорость гидролиза α-NA) [20]. Известно также, что карбоксилэстеразы насекомых, даже у близкородственных видов, могут иметь различные характеристики и свойства, не связанные с резистентностью к ксенобиотикам [6, 10]. Например, при использовании в качестве субстрата α-NA более высокая специфическая активность CarE была отмечена у табачного жука (Lasioderma serricorne), чем у аптечного жука (Stegobium paniceum) [9]. В другом исследовании наблюдали варьирование кинетических параметров (Km и Vmax) карбоксилэстеразы при использовании в качестве субстрата β-NA между представителями 6-ти рас тутового шелкопряда (Bombyx mori) [19].

Поскольку выявляемая карбоксилэстеразная активность может зависеть от выбранного для ее определения субстрата или расы/линии насекомых, не всегда ясно, использование какого субстрата даст надежные результаты при оценке характеристик CarE конкретного вида насекомых под воздействием инсектицидов. В отношении модельных организмов полезно иметь наиболее полную характеристику ферментов, которые могут быть вовлечены в обеспечение устойчивости к инсектицидам. Цель работы – сравнение активности и кинетических параметров (Km, Vmax) карбоксилэстераз самцов и самок Musca domestica L. 2-х лабораторных линий.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Для данного исследования были использованы имаго (самки, самцы) 2-х лабораторных линий Musca domestica L. – TY и UF. Первая линия (TY) получена из Новосибирского аграрного университета в 2009 г., вторая (UF) – из Института биохимии и генетики УФИЦ РАН в 2023 г. Обе линии содержались без контакта с инсектицидами в инсектарии Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной энтомологии и арахнологии – филиале Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра Тюменского научного центра Сибирского отделения Российской академии наук.

Были использованы следующие химические реактивы: EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота, ≥ 99.0%), PTU (N-фенилтиомочевина, ≥98.0%), PMSF (фенилметилсульфонил фторид, > 98.5%), DTE (1,4-дитиоэритритол, ≥99.0%), Triton X-100 (2-[4-(2,4,4-триметилпентан-2-ил) фенокси]этанол, ≥100.0%), 1-нафтол (≥99%), α-NA (1-нафтил ацеат, ≥98%), 2-нафтол (≥99%), β-NA (2-нафтил ацетат), ρ-NPA (4-нитрофенил ацетат, ≥98.0%) – производство Sigma-Aldrich, Германия; Реактив Фолина–Чокалтеу – AppliChem, Италия; остальные реактивы (С₂Н₃N, Na₂CO₃, NaOH, Na₃C₆H₅O₇, CuSO₄, NaH₂PO₄ и Na₂HPO₄) –марки ЧДА отечественного производства (ЗАО “Химприбор”, ООО “Компонент Реактив”, ООО “АО РЕАХИМ”).

Из особей M. domestica готовили индивидуальные гомогенаты с использованием стеклянной ступки и пестика, на холоде, с добавлением 0.1 М фосфатного буфера рН 7.6, содержащего 1 мМ EDTA, 1 мМ PTU, 1 мМ PMSF, 1 мМ DTE, 1% Triton X-100. Затем гомогенаты центрифугировали в течение 2 мин при 12500 об./мин. Полученные супернатанты использовали для определения эстеразной активности [21] и количественного определения белка по Лоури [22], используя БСА в качестве стандарта.

Ферментативную активность определяли по скорости гидролиза специфичного субстрата (α-NA, β-NA, ρ-NPA) [21] на микропланшетном фотометре Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific Inc., Финляндия). Для определения удельной ферментативной активности измерение проводили с использованием следующих концентраций соответствующих субстратов: 0.3 мМ α-NA, 0.3 мМ β-NA, 1 мМ ρ-NPA. Для установления кинетических параметров измерение активности проводили при 5-ти концентрациях каждого из субстратов.

При измерении активности CarE к гомогенатам добавляли соответствующий специфический субстрат (α-NA и β-NA соответственно) в фосфатном буфере (20 мM pH 7.2). После 5-минутной инкубации при комнатной температуре реакцию останавливали при помощи 3% SDS с 0.3% Fast Blue и измеряли поглощение при 540 нм в режиме “конечная точка” [21, 23]. При измерении активности ρ-NPA-эстеразной активности к гомогенатам добавляли смесь ρ-NPA и фосфатного буфера (50 мM pH 7.2). Измеряли поглощение при 405 нм, 30℃, в течение 5 мин с интервалом в 15 с в режиме “кинетика” [21]. Кинетические параметры (Km, Vmax) определяли путем построения графиков Лайнуивера–Берка на основании полученной эстеразной активности по отношению к различным концентрациям специфических субстратов.

Статистический анализ результатов определения активности и кинетических параметров (Km, Vmax) карбоксилэстераз проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и критерия Тьюки–Крамера для множественных сравнений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее было показано, что карбоксилэстеразная активность насекомых может варьировать в зависимости от использованного субстрата фермента, а в отношении одного и того же субстрата – в зависимости от вида [10, 24] и пола особей внутри одного вида [18]. В ходе настоящей работы для оценки активности и кинетических параметров эстераз (Km, Vmax) M. domestica было использовано 3 специфических субстрата: α-нафтил ацетат, β-нафтил ацетат и ρ-нитрофенил ацетат (рис. 1).

 

Рис. 1. Гидролиз карбоксилэстеразами различных субстратов: (а) – α-нафтил ацетат (α-NA), (б) – β-нафтил ацетат (β-NA), (в) – ρ-нитрофенил ацетат (ρ-NPA) [17]

 

Данные соединения традиционно используют в качестве субстратов для измерения активности разных изоферментов эстераз [25].

Наименьшие показатели удельной активности CarE независимо от использованного субстрата отмечены у самцов линии UF. Активность фермента в отношении β-NA и ρ-NPA у данной группы насекомых была в 1.75 и 1.53 раза соответственно меньше, чем у самцов линии TY. Также были отмечены статистически значимые отличия удельной активности CarE относительно β-NA и ρ-NPA между самками и самцами линии UF: у самцов активность была в 1.57 и 1.62 раза меньше. Удельная активность у самцов линии TY в отношении α-NA и β-NA была в 1.29 (p = 0.30) и в 1.24 (p = 0.11) раза соответственно меньше, чем у самок данной линии (рис. 2).

 

Рис. 2. Удельная активность карбоксилэстеразы имаго Musca domestica линий TY и UF в зависимости от субстрата фермента и пола насекомых (m ± SD): m –среднее, SD – стандартное отклонение; α-NA – α-нафтил ацетат, β-NA – β-нафтил ацетат, ρ-NPA – ρ-нитрофенил ацетат; n – объем выборки, ΔOD – изменение оптической плотности; величины, статистическая значимость отличий согласно критерию Тьюки–Крамера (p ≤0.05): * – между 2-мя линиями в пределах одного пола; × – между полами в пределах одной линии; ∆ – в сравнении с α-NA-активностью особей аналогичной группы

 

В нашем исследовании у особей линии TY величины Km и Vmax, полученные при использовании в качестве субстрата α-NA, были сопоставимы с показателями, полученными при использовании β-NA. У самок линии UF максимальная скорость гидролиза α- и β-NA не отличалась, а у самцов данной линии максимальная скорость гидролиза β-NA была в 2.14 раза меньше, чем α-NA (p ≤ 0.05) (табл. 1).

 

Таблица 1. Кинетические параметры карбоксилэстераз имаго Musca domestica L. (m ± SD).

Линия	Пол	n	Km, мМ	Vmax, мкг нитрофенола/мин/мг белка
α-NA
TY	♀	10	0.037 ± 0.021	0.933 ± 0.382
	♂	12	0.047 ± 0.036	0.771 ± 0.357
UF	♀	13	0.023 ± 0.006	0.682 ± 0.216
	♂	13	0.032 ± 0.016	0.814 ± 0.457
β-NA
TY	♀	14	0.032 ± 0.011	0.814 ± 0.185
	♂	11	0.040 ± 0.013	0.721 ± 0.187
UF	♀	14	0.036 ± 0.020	0.596 ± 0.162*×
	♂	14	0.034 ± 0.016	0.380 ± 0.085*∆
ρ-NPA
Линия	Пол	n	Km, мМ	Vmax, ΔOD/мин/мг белка
TY	♀	14	0.352 ± 0.228	0.477 ± 0.160
	♂	12	0.286 ± 0.153	0.388 ± 0.088
UF	♀	10	0.177 ± 0.086	0.395 ± 0.093
	♂	11	0.376 ± 0.177	0.302 ± 0.099

Примечание: m – среднее, SD – стандартное отклонение; TY, UF – разные линии Musca domestica, n – объем выборки, ΔOD – изменение оптической плотности, величины, статистическая значимость отличий согласно критерию Тьюки–Крамера (p ≤ 0.05): * – между 2-мя линиями в пределах одного пола, × – между полами в пределах одной линии, ∆ – в сравнении с α-NA-активностью особей аналогичной группы.

 

Однофакторный дисперсионный анализ не выявил статистически значимого варьирования величин кинетических параметров (Km, Vmax) между группами насекомых при использовании для измерения активности α-NA в качестве субстрата. В работе [20] при исследовании кинетических параметров α-NA- и β-NA-эстераз 2-х близкородственных видов муравьев (Solenopsis invicta, S. richteri) была отмечена статистически достоверная разница между кинетическими параметрами для α-NA разных колоний S. invicta, но не S. richteri. Анализ кинетических параметров фермертов хлебного точильщика (Stegobium paniceum) и табачного жука (Lasioderma serricorne) показал, что у особей S. paniceum отмечена более высокая величина Km и более низкая – Vmax (ниже – каталитическая активность) при использовании субстрата α-NA, чем у L. serricorne (p ≤ 0.05) [9].

Статистически достоверных отличий Km при определении активности β-NA-эстеразы в ходе исследования обнаружено не было (табл. 1). Выявлены межполовые и межпопуляционные статистически значимые отличия Vmax. Величина Vmax CarE самцов линии UF была меньше, чем самок той же линии в 1.57 раза (p ≤ 0.05). Фермент особей линии UF характеризовался меньшей скоростью гидролиза β-NA. Величины Vmax фермента самок и самцов линии UF были в 1.37 и в 1.90 раза (p ≤ 0.05) соответственно меньше, чем особей того же пола линии TY. Полученные результаты соответствуют данным других авторов. В уже упоминавшемся исследовании [20] для β-NA было отмечено статистически достоверное варьирование кинетических параметров фермента между колониями S. invicta, у другого вида (S. richteri) такие отличия не обнаружили. При изучении кинетических параметров β-NA-эстеразы у 6-ти рас тутового шелкопряда (Bombyx mori) самая высокая и низкая величина Km отмечена у рас PMX (0.1175 мМ) и AP 12 (0.0368 мМ) соответственно, максимальная Vmax была отмечена у расы Hosa Mysore (0.25 мM/мин), минимальная – MU-1 (0.0539 мM/мин) [19]. В отношении ρ-NPA-эстеразы было отмечено, что у самок линии UF величина Km была наименьшей: меньше, чем у самцов той же линии в 2.12 раза и чем у самок TY-линии – в 1.99 раза (табл. 1). Анализ величин Vmax не выявил межпопуляционных и межполовых отличий. Ранее в результате исследования кинетических параметров серинэстеразы EST-4 2-х близкородственных видов дрозофил (Drosophila mulleri, D. arizonae) выявлено, что при использовании субстрата ρ-NPA величина Km была намного меньше у D. mulleri (0.17 мМ), чем у D. arizonae (0.74 мМ). Однако, хотя сродство EST-4 к этому субстрату у D. mulleri было намного больше, его максимальная скорость была в 20 раз меньше (0.94 мМ/мин), чем у D. arizonae (19.33 мМ/мин) [24].

Варьирование кинетических параметров свидетельствуют о разном сродстве фермента к субстрату, эффективности его утилизации и скорости ферментативного гидролиза у разных линий или рас насекомых [19]. Такое варьирование может быть обусловлено особенностями среды обитания. Например, кинетические исследования эстераз с использованием субстратов α- и β-NA у 3-х популяций кузнечиков Oxya chinensis из сред с разной интенсивностью и продолжительностью воздействия малатиона показали, что величины Кm были близкими, а величины Vmax варьировали у самок и самцов в 3-х популяциях. Показатели Vmax самок были больше, чем у самцов в популяциях BD (Baodi: высокая интенсивность воздействия ранее, но низкая в настоящее время) и JN (Jinnan: высокая интенсивность воздействия), тогда как в популяции BDG (Beidagang: низкая интенсивность воздействия) величины Vmax самцов были больше, чем самок со всеми субстратами [18].

Для многих ферментов насекомых характерен половой диморфизм и изменение активности в онтогенезе. Например, в ряде работ представлены данные о том, что у самок дрозофилы (D. melanogaster) активность ацетилхолинэстеразы меньше, чем у самцов [26, 27]. В исследовании [28] по оценке возрастных изменений гексозоизомеразной, эстеразной, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназной и фосфатазной активностей у D. melanogaster было показано, что эстеразная активность с возрастом увеличивалась, при этом у самцов обнаружено более значительное увеличение активности с возрастом (в 2.6 раза по сравнению с молодыми самцами), чем у самок (в 1.5 раза по сравнению с молодыми самками). В нашем исследовании отличия характеристик CarE в зависимости от пола выявлены как у особей линии UF (β-NA-эстеразная и ρ-NPA-эстеразная активности самцов были меньше).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты определения кинетических параметров эстеразной активности имаго Musca domestica L. указывали на наличие межпопуляционных различий у 2-х лабораторных линий (TY и UF). У особей линии TY скорости гидролиза двух субстратов (α- и β-NA) не различались статистически значимо (как самок, так и самцов), в то время как у особей линии UF скорость гидролиза разных субстратов отличалась в зависимости от пола: у самцов скорость гидролиза β-NA была меньше, чем скорость гидролиза α-NA. У особей линии UF отмечены статистически значимые отличия величин Vmax и удельной β-NA-эстеразной активности и ρ-NPA-эстеразной активности в зависимости от пола, что не обнаружено у представителей линии TY. О межпопуляционных различиях свидетельствовали также меньшие величины максимальной скорости гидролиза β-NA ферментом особей линии UF относительно данного параметра особей линии TY.

Полученные результаты позволили определить наиболее подходящий субстрат для выявления межполовых и межпопуляционных особенностей активности и кинетических параметров эстераз насекомых на примере M. domestica. Поскольку при использовании в качестве субстрата α-NA были получены более стабильные результаты, то данный субстрат предпочтителен для измерения ферментативной активности карбоксилэстеразы модельных насекомых M. domestica разных линий. В дальнейшей работе необходимо оценить, будут ли сохраняться обнаруженные особенности активности кинетических параметров фермента при остром и хроническом воздействии инсектицидами на имаго M. domestica, а также выявить оптимальный субстрат CarE для обнаружения сублетальных эффектов инсектицидов.

Sobre autores

A. Kinareikina

All-Russian Scientific Research Institute of Veterinary Entomology and Arachnology – Branch of Federal State Institution Federal Research Centre Tyumen Scientific Centre of Siberian Branch of the RAS

Email: sylivanovaea@mail.ru
Rússia, Tyumen

E. Silivanova

All-Russian Scientific Research Institute of Veterinary Entomology and Arachnology – Branch of Federal State Institution Federal Research Centre Tyumen Scientific Centre of Siberian Branch of the RAS

Autor responsável pela correspondência
Email: sylivanovaea@mail.ru
Rússia, Tyumen

Bibliografia

Arquivos suplementares